و دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole) هو صبغ من قبل الملكية الفلورسنت بمثابة و علامة، وتستخدم على نطاق واسع في فن المجهر مضان أو التدفق الخلوي، وغيرها. إن الفلورة التي تنبعث منها زرقاء ساطعة ، وتحدث الإثارة بين 455-461 نانومتر (ضوء الأشعة فوق البنفسجية).
يمكن لصبغة DAPI أن تمر عبر غشاء الخلية للخلايا الميتة بسهولة كبيرة. يمكن أن تلطخ أيضًا نوى الخلايا الحية ، ولكن في هذه الحالة ، يجب أن يكون تركيز هذا أعلى.
التركيب الكيميائي للصبغة الفلورية DAPI. المصدر: Image: File: DAPI.svg هو نسخة متجهية لهذا الملف. يجب استخدامها بدلاً من هذه الصورة النقطية عندما لا تكون أدنى / صورة معدلة لريتشارد ويلر (Zephyris)
الصبغة قادرة على الوصول إلى الحمض النووي الخلوي الذي لها صلة خاصة بها ، وترتبط بشغف كبير بالقواعد النيتروجينية الأدينين والثيمين. لهذا السبب فهي مفيدة جدًا في بعض تقنيات البيولوجيا الجزيئية.
ينتمي هذا المركب إلى مجموعة أصباغ الإندول وقد ثبت أنه يتمتع بحساسية أكبر تجاه الحمض النووي من بروميد الإيثيديوم ويوديد البروبيديوم ، خاصة على المواد الهلامية من الأغاروز.
استخدام هذه الصبغة الفلورية واسع جدًا ، حيث أنه مفيد في: دراسة التغيرات في الحمض النووي في عمليات الاستماتة (موت الخلايا) وبالتالي اكتشاف الخلايا في هذه العملية ؛ لصورة بصمة الحمض النووي (طباعة صور الحمض النووي) ؛ لدراسة التلوث الجرثومي. أو لتصور التجزئة النووية.
كما تم استخدامه في دراسة العصابات الصبغية ، وفي اكتشاف Mycoplasmas sp DNA ، وفي تفاعل الحمض النووي مع البروتين ، وفي تلطيخ الخلايا وعدها عن طريق التألق المناعي وحتى تلوين حبوب اللقاح الناضجة.
مميزات
DAPI هو اختصار لاسمها الكيميائي (4 '، 6-دياميدينو-2-فينيل إندول). صيغته الجزيئية هي C 16 H 15 N 5. وله وزن جزيئي 350.3. بالقرب من نطاق ضوء الأشعة فوق البنفسجية (345 إلى 358 نانومتر) يحدث أقصى إثارة لمركب DAPI-DNA ، بينما يحدث الحد الأقصى لانبعاث الفلورة بين 455-461 نانومتر.
تتميز هذه الصبغة بأنها مسحوق أصفر ، ولكن الهياكل المميزة بضوء الفلوروفور هذا ينبعث منها ضوء أزرق لامع.
إنه مركب قابل للذوبان في الماء ، ومع ذلك ، لتسريع انحلاله ، يمكن تطبيق بعض الحرارة. يمكن تخفيفه باستخدام برنامج تلفزيوني ولكن لا يتم إذابته بشكل مباشر.
بمجرد تحضير الصبغة ، يجب تخزينها في الظلام ، أي محمية من الضوء ، عند درجة حرارة من 2 إلى 8 درجات مئوية (الثلاجة). في ظل هذه الظروف ، تكون الصبغة مستقرة لأكثر من 3 أسابيع أو أشهر.
إذا كانت محمية من الضوء ولكنها تُركت في درجة حرارة الغرفة ، ينخفض ثباتها إلى أسبوعين أو ثلاثة أسابيع ، ولكن تتعرض للضوء المباشر يكون التدهور سريعًا جدًا. إذا كنت ترغب في التخزين لفترة أطول ، فيمكن تبريده عند -20 درجة مئوية وتوزيعه في قسامات.
أساس
يعتمد هذا التلوين على توليد صبغة نووية في تقنيات البيولوجيا الجزيئية الرئيسية ، مثل: قياس التدفق الخلوي ، والفحص المجهري الفلوري ، وتلطيخ كروموسومات الطور أو نوى الطور البيني ، من بين أمور أخرى.
تعتمد هذه التقنية على التقارب الكبير الذي تتمتع به الصبغة للقواعد النيتروجينية (الأدينين والثايمين) الموجودة في المادة الوراثية (DNA) في الأخدود الصغير. بينما في المستوى السيتوبلازمي ، فإنه يترك خلفية قليلة جدًا.
عندما ترتبط الصبغة الفلورية بمناطق الأدينين والثيمين في الحمض النووي ، يزداد التألق بشكل كبير (20 مرة أكثر). اللون الذي يصدره أزرق فاتح. والجدير بالذكر أنه لا يوجد انبعاث مضان عند الارتباط بأزواج قاعدة GC (جوانين - سيتوزين).
من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من أن لها أيضًا تقارب مع الحمض النووي الريبي ، إلا أن هذا لا يسبب مشكلة ، لأن أعلى درجة من انبعاث الطاقة من هذا الجزيء تحدث عند طول موجي آخر (500 نانومتر) ، على عكس الحمض النووي ، الذي يحدث عند 460 نانومتر. علاوة على ذلك ، فإن الزيادة في التألق بمجرد ارتباطه بـ RNA هي 20 ٪ فقط.
يستخدم DAPI أكثر لتلطيخ الخلايا الميتة (الثابتة) من الخلايا الحية ، نظرًا لأن هناك حاجة إلى تركيز أعلى بكثير من الصبغة لتلطيخ الأخير ، وذلك لأن غشاء الخلية يكون أقل نفاذاً إلى DAPI عندما يكون على قيد الحياة.
يمكن استخدام صبغة DAPI مع الفلوروفورات الحمراء والخضراء لتجربة متعددة الألوان.
استعمال
DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-phenylindole) هو مادة فلوروفور ممتازة وبالتالي فهو يستخدم على نطاق واسع في تقنيات مختلفة ولأغراض مختلفة. يوضح ما يلي استخدام DAPI في التقنيات الرئيسية.
التدفق الخلوي
كان الباحثون Gohde و Schumann و Zante في عام 1978 أول من استخدم واقترح DAPI باعتباره مادة الفلوروفور في تقنية قياس التدفق الخلوي ، وقد حقق نجاحًا كبيرًا بسبب حساسيته العالية للحمض النووي وشدته العالية في انبعاث الفلورة.
يسمح استخدام DAPI في هذه التقنية بدراسة دورة الخلية وتقدير الخلايا وتلطيخ الخلايا الحية والميتة.
على الرغم من وجود ملونات أخرى ، مثل بروميد الإيثيديوم ، وأكسيد هوشست ، والبرتقال أكريدين ، ويوديد البروبيديوم ، فإن DAPI هو أحد أكثر الملونات استخدامًا لأنه أكثر مقاومة للضوء من تلك المذكورة سابقًا.
بالنسبة لهذه التقنية ، يلزم إصلاح الخلايا ، لذلك ، يمكن استخدام الإيثانول المطلق أو بارافورمالدهيد بنسبة 4 ٪. يتم طرد العينة بالطرد المركزي ويتم التخلص من المادة الطافية ، وبالتالي يتم ترطيب الخلايا بإضافة 5 مل من محلول PBS المؤقت لمدة 15 دقيقة.
أثناء انقضاء الوقت ، قم بإعداد وصمة عار DAPI باستخدام محلول تلطيخ (FOXP3 من BioLegend) بتركيز 3 ميكرومتر.
الطرد المركزي للعينة ، وتجاهل المادة طافية ، ثم تغطيتها بـ 1 مل من محلول DAPI لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
خذ العينة إلى مقياس التدفق الخلوي بالليزر المناسب.
قياس التدفق الدقيق
هناك تقنية أخرى تُستخدم فيها DAPI وهي في قياس التدفق الدقيق مع فلوروفور آخر يسمى ميثراميسين. كلاهما مفيد لقياس الحمض النووي للبلاستيدات الخضراء بشكل فردي ، ولكن DAPI هو الأنسب لقياس جسيمات T4 العاثية.
تهجين
تستخدم هذه التقنية أساسًا مجسات الحمض النووي المسمى بصبغة الفلورسنت التي يمكن أن تكون DAPI.
تتطلب العينة معالجة حرارية لإفساد الحمض النووي المزدوج الشريطة وتحويله إلى خيطين منفردتين. يتم تهجينه لاحقًا باستخدام مسبار DNA المشوه الذي يحمل علامة DAPI والذي يحتوي على سلسلة من الاهتمامات.
في وقت لاحق يتم غسلها لإزالة ما لم يتم تهجينه ، يتم استخدام التباين لتصور الحمض النووي. يسمح مجهر التألق بمراقبة المسبار المهجن.
تهدف هذه التقنية إلى اكتشاف تسلسلات معينة في الحمض النووي الصبغي ، لتكون قادرة على تشخيص أمراض معينة.
كانت هذه التقنيات الجزيئية الخلوية مفيدة للغاية في تحديد التفاصيل في دراسة الأنماط النووية. على سبيل المثال ، أظهر المناطق الغنية بالأزواج القاعدية من الأدينوزين والثايمين التي تسمى المناطق غير المتجانسة أو نطاقات DAPI.
تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الكروموسومات والكروماتين في النباتات والحيوانات ، وكذلك في تشخيص أمراض الدم قبل الولادة وأمراض الدم لدى البشر.
في هذه التقنية ، يكون تركيز DAPI الموصى به هو 150 نانوغرام / مل لمدة 15 دقيقة.
يجب تخزين الشرائح المجمعة محمية من الضوء عند 2-8 درجة مئوية.
تلطيخ المناعي
تم إصلاح الخلايا بنسبة 4٪ لامتصاص العرق. في حالة استخدام بقع أخرى ، يتم ترك DAPI في النهاية كبقع مضاد ويتم تغطية الخلايا بمحلول PBS لمدة 15 دقيقة. أثناء مرور الوقت ، قم بإعداد محلول DAPI عن طريق التخفيف باستخدام PBS ، بحيث يكون التركيز النهائي 300 ميكرومتر.
ثم يتم إزالة PBS الزائد وتغطيته بـ DAPI لمدة 5 دقائق. يغسل عدة مرات. يتم عرض الشريحة تحت مجهر مضان تحت المرشح المناسب.
ورقة السلامة
يجب التعامل مع هذا المركب بعناية ، لأنه مركب له خصائص مطفرة. يتم استخدام الكربون المنشط لإزالة هذا المركب من المحاليل المائية التي سيتم التخلص منها.
يجب استخدام القفازات والعباءات ونظارات السلامة لتجنب الحوادث مع هذا الكاشف. في حالة حدوث تلامس مع الجلد أو الغشاء المخاطي ، يجب غسل المنطقة بما يكفي من الماء.
يجب ألا تمص هذا الكاشف عن طريق الفم ، استخدم الماصات.
لا تلوث الكاشف بالعوامل الميكروبية لأن ذلك سيؤدي إلى نتائج خاطئة.
لا تخفف بقعة DAPI أكثر من الموصى بها ، لأنها ستقلل بشكل كبير من جودة البقعة.
لا تعرض الكاشف للضوء المباشر ، أو تدفئته لأن هذا يقلل من التألق.
المراجع
- Brammer S و Toniazzo C و Poersch L. Corantes تشارك بشكل شائع في علم الوراثة الخلوية النباتية. Arq. Inst. بيول. 2015 ، 82. متاح من: scielo.
- مختبرات إمباث. دابي. متاح على: menarinidiagnostics.com/
- مختبرات سيتوسيل. 2019. تعليمات لاستخدام DAPI. متاح في cytocell.com
- Elosegi A، Sabater S. مفاهيم وتقنيات في بيئة النهر. (2009). افتتاحية روبيس ، إسبانيا. متاح على: books.google.co.ve/
- Novaes R ، Penitente A ، Talvani A ، Natali A ، Neves C ، Maldonado I. استخدام التألق في طريقة التشريح المعدلة لتقدير عدد الخلايا العضلية في أنسجة القلب. القوس. كارديول. 2012 ؛ 98 (3): 252-258. متوفر من: scielo.
- Rojas-Martínez R، Zavaleta-Mejía E، Rivas-Valencia P. وجود الفيتوبلازما في البابايا (Carica papaya) في المكسيك. مجلة تشابينغو. سلسلة البستنة ، 2011 ؛ 17 (1) ، 47-50. متاح على: scielo.org.