إنزيمات التقييد: وظائف وأنواع وأمثلة - مادة الاحياء

و أنزيمات التقييد هي نوكلياز داخلي تستخدمها العتيقة والبكتيريا معين لمنع أو "تقييد" انتشار الفيروسات في الداخل. وهي شائعة بشكل خاص في البكتيريا وهي جزء من نظام دفاعها ضد الحمض النووي الغريب المعروف باسم نظام التقييد / التعديل.

تعمل هذه الإنزيمات على تحفيز انقسام الحمض النووي مزدوج النطاق في مواقع محددة ، بشكل قابل للتكاثر وبدون استخدام طاقة إضافية. تتطلب معظمها وجود عوامل مساعدة مثل المغنيسيوم أو الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى ، على الرغم من أن بعضها يتطلب أيضًا ATP أو S-adenosyl methionine.

مخطط تفاعل إنزيم تقييد HindIII (المصدر: Helixitta عبر ويكيميديا كومنز)

تم اكتشاف نوكليازات تقييدية في عام 1978 من قبل دانيال ناثانز وأربر فيرنر وهاملتون سميث ، الذين حصلوا على جائزة نوبل في الطب لاكتشافهم. يُشتق اسمهم بشكل عام من الكائن الحي الذي لوحظوا فيه لأول مرة.

تستخدم هذه الإنزيمات على نطاق واسع في تطوير طرق استنساخ الحمض النووي وغيرها من استراتيجيات البيولوجيا الجزيئية والهندسة الوراثية. إن خصائص التعرف على التسلسل المحددة والقدرة على قطع التسلسلات القريبة من مواقع التعرف تجعلها أدوات قوية في التجارب الجينية.

يمكن استخدام الشظايا الناتجة عن إنزيمات التقييد التي عملت على جزيء DNA معين لإعادة إنشاء "خريطة" للجزيء الأصلي باستخدام معلومات حول المواقع التي يقطع فيها الإنزيم الحمض النووي.

قد يكون لبعض إنزيمات التقييد نفس موقع التعرف على الحمض النووي ، لكنها لا تقطعها بالضرورة بنفس الطريقة. وبالتالي ، هناك إنزيمات تقطع أطرافًا غير حادة ، وإنزيمات تقطع تاركة أطرافًا متماسكة ، والتي لها تطبيقات مختلفة في البيولوجيا الجزيئية.

يوجد حاليًا المئات من إنزيمات التقييد المختلفة المتاحة تجاريًا ، والتي تقدمها بيوت تجارية مختلفة ؛ تعمل هذه الإنزيمات كمقص جزيئي "مخصص" لأغراض مختلفة.

المميزات

تؤدي إنزيمات التقييد الوظيفة المعاكسة للبوليميراز ، لأنها تتحلل أو تكسر رابطة الإستر داخل رابطة الفسفوديستر بين النيوكليوتيدات المجاورة في سلسلة نوكليوتيد.

في البيولوجيا الجزيئية والهندسة الوراثية ، تُستخدم على نطاق واسع كأدوات لبناء نواقل التعبير والاستنساخ ، وكذلك لتحديد متواليات معينة. كما أنها مفيدة في بناء الجينومات المؤتلفة ولديها إمكانات تكنولوجية حيوية كبيرة.

تستخدم التطورات الحديثة في العلاج الجيني حاليًا إنزيمات تقييدية لإدخال جينات معينة في نواقل تكون مركبات لنقل مثل هذه الجينات إلى الخلايا الحية ، والتي من المحتمل أن يكون لها القدرة على الاندماج في الجينوم الخلوي لأداء تغييرات دائمة.

آلية العمل

يمكن أن تحفز إنزيمات التقييد انقسام الحمض النووي مزدوج النطاق ، على الرغم من أن بعضها قادر على التعرف على تسلسل الحمض النووي أحادي النطاق وحتى RNA. يحدث القطع بعد التعرف على التسلسلات.

تتكون آلية العمل من التحلل المائي لرابطة الفوسفوديستر بين مجموعة الفوسفات و deoxyribose في الهيكل العظمي لكل خيط DNA. العديد من الإنزيمات قادرة على القطع في نفس الموقع الذي تتعرف عليه ، بينما يقوم البعض الآخر بقطع ما بين 5 و 9 أزواج قاعدية قبله أو بعده.

عادةً ما تقطع هذه الإنزيمات عند الطرف الخامس من مجموعة الفوسفات ، مما يؤدي إلى ظهور شظايا الحمض النووي بنهاية 5 فوسفوريل ونهاية هيدروكسيل طرفية 3 بوصات.

نظرًا لأن البروتينات لا تتلامس مباشرة مع موقع التعرف في الحمض النووي ، فيجب نقلها على التوالي حتى يتم الوصول إلى الموقع المحدد ، ربما عن طريق آليات "انزلاق" على خيط DNA.

أثناء الانقسام الأنزيمي ، يتم وضع رابطة الفوسفوديستر لكل من خيوط الحمض النووي داخل أحد المواقع النشطة لأنزيمات التقييد. عندما يغادر الإنزيم موقع التعرف والانقسام ، فإنه يفعل ذلك من خلال روابط عابرة غير محددة.

أنواع

خمسة أنواع من إنزيمات التقييد معروفة حاليًا. فيما يلي وصف موجز لكل واحد:

النوع الأول من إنزيمات التقييد

هذه الإنزيمات عبارة عن بروتينات خماسية كبيرة تحتوي على ثلاث وحدات فرعية ، واحدة للتقييد ، وواحدة للمثيلة ، وواحدة للتعرف على التسلسل في الحمض النووي. هذه نوكليازات داخلية هي بروتينات متعددة الوظائف قادرة على تحفيز تفاعلات التقييد والتعديل ، ولديها نشاط ATPase وأيضًا توبويزوميراز DNA.

كانت الإنزيمات من هذا النوع هي أول نوكليازات داخلية يتم اكتشافها ، وقد تمت تنقيتها لأول مرة في الستينيات وتم دراستها بعمق كبير منذ ذلك الحين.

لا تُستخدم إنزيمات النوع الأول على نطاق واسع كأداة للتكنولوجيا الحيوية ، حيث يمكن أن يكون موقع الانقسام على مسافة متغيرة تصل إلى 1000 زوج أساسي من موقع التعرف ، مما يجعلها غير موثوقة من حيث إمكانية التكاثر التجريبي.

إنزيمات تقييد النوع الثاني

وهي عبارة عن إنزيمات تتكون من متجانسات أو رباعيات تقطع الحمض النووي في مواقع محددة يتراوح طولها بين 4 و 8 نقاط أساس. عادة ما تكون مواقع الانقسام هذه متجانسة ، أي أنها تتعرف على التسلسلات التي تُقرأ بنفس الطريقة في كلا الاتجاهين.

تقطع العديد من إنزيمات التقييد من النوع الثاني في البكتيريا الحمض النووي عندما تتعرف على طابعه الغريب ، لأنه لا يحتوي على التعديلات النموذجية التي يجب أن يمتلكها الحمض النووي الخاص به.

هذه هي أبسط إنزيمات تقييدية لأنها لا تتطلب أي عامل مساعد بخلاف المغنيسيوم (Mg +) للتعرف على تسلسل الحمض النووي وقطعه.

إن دقة إنزيمات التقييد من النوع الثاني في التعرف على التسلسلات البسيطة في الحمض النووي وقطعها في مواضع دقيقة تجعلها واحدة من أكثر الأنواع استخدامًا ولا غنى عنها في معظم فروع البيولوجيا الجزيئية.

ضمن مجموعة إنزيمات التقييد من النوع الثاني ، توجد فئات فرعية متعددة مصنفة وفقًا لخصائص معينة فريدة لكل منها. يتم تصنيف هذه الإنزيمات عن طريق إضافة أحرف الأبجدية ، من الألف إلى الياء بعد اسم الإنزيم.

بعض الفئات الفرعية المعروفة بفائدتها هي:

الفئة الفرعية IIA

هم ثنائيات من وحدات فرعية مختلفة. يتعرفون على التسلسلات غير المتماثلة ويستخدمون كسلائف مثالية لتوليد إنزيمات القطع.

الفئة الفرعية IIB

وهي مكونة من ثنائيات واحدة أو أكثر وتقطع الحمض النووي على جانبي تسلسل التعرف. قاموا بقص كل من خيوط الحمض النووي بفاصل زوج أساسي قبل موقع التعرف.

فئة فرعية IIC

الإنزيمات من هذا النوع هي عديد الببتيدات مع وظائف تقسيم وتعديل خيوط الحمض النووي. تقطع هذه الإنزيمات كلا الخيوط بشكل غير متماثل.

الفئة الفرعية IIE

إن إنزيمات هذه الفئة الفرعية هي الأكثر استخدامًا في الهندسة الوراثية. لديهم موقع تحفيزي ويتطلبون بشكل عام مؤثر خيفي. تحتاج هذه الإنزيمات إلى التفاعل مع نسختين من تسلسل التعرف عليها لأداء انقسام فعال. ضمن هذه الفئة الفرعية توجد الإنزيمات EcoRII و EcoRI.

إنزيمات تقييد النوع الثالث

تتكون نوكليازات التقييد من النوع الثالث من وحدتين فرعيتين فقط ، واحدة مسؤولة عن التعرف على الحمض النووي وتعديله ، بينما الأخرى مسؤولة عن الانقسام التسلسلي.

تتطلب هذه الإنزيمات عاملين مساعدين لوظيفتها: ATP والمغنيسيوم. تمتلك إنزيمات التقييد من هذا النوع موقعين للتعرف غير المتماثل ، وتنقل الحمض النووي بطريقة تعتمد على ATP وتقطعها بين 20-30 نقطة أساس متاخمة لموقع التعرف.

إنزيمات تقييد النوع الرابع

من السهل التعرف على إنزيمات النوع الرابع لأنها تقطع الحمض النووي بعلامات مثيلة ، فهي تتكون من عدة وحدات فرعية مختلفة مسؤولة عن التعرف على تسلسل الحمض النووي وقطعه. تستخدم هذه الإنزيمات GTP والمغنيسيوم ثنائي التكافؤ كعوامل مساعدة.

تشمل مواقع الانقسام المحددة خيوط النيوكليوتيدات مع بقايا السيتوزين الميثيل أو الهيدروكسي ميثيل على واحد أو كلا خيوط الأحماض النووية.

إنزيمات تقييد النوع الخامس

يجمع هذا التصنيف إنزيمات من نوع CRISPER-Cas ، والتي تحدد وتقطع تسلسلات DNA معينة من الكائنات الغازية. تستخدم إنزيمات كاس خيطًا من الحمض النووي الريبي التوجيهي CRISPER المركب للتعرف على الكائنات الغازية ومهاجمتها.

الإنزيمات المصنفة على أنها النوع الخامس عبارة عن عديد ببتيدات منظمة بواسطة إنزيمات النوع الأول والثاني والثاني. يمكنهم قطع أجزاء من الحمض النووي لأي كائن حي تقريبًا وبنطاق واسع من الطول. تجعل مرونتها وسهولة استخدامها هذه الإنزيمات واحدة من أكثر الأدوات استخدامًا في الهندسة الوراثية اليوم ، إلى جانب إنزيمات النوع الثاني.

أمثلة

تم استخدام إنزيمات التقييد للكشف عن تعدد أشكال الحمض النووي ، خاصة في الدراسات الوراثية السكانية والدراسات التطورية باستخدام الحمض النووي للميتوكوندريا ، من أجل الحصول على معلومات حول معدلات بدائل النوكليوتيدات.

حاليًا ، تمتلك النواقل المستخدمة في تحويل البكتيريا لأغراض مختلفة مواقع متعددة النسيلة حيث توجد مواقع التعرف على إنزيمات تقييد متعددة.

من بين هذه الإنزيمات الأكثر شيوعًا ، EcoRI و II و III و IV و V ، التي تم الحصول عليها ووصفها لأول مرة من E. coli ؛ HindIII من المستدمية النزلية و BamHI من B. amyloliquefaciens.

المراجع

بيكل ، تا ، وكروجر ، دي إتش (1993). بيولوجيا تقييد الحمض النووي. المراجعات الميكروبيولوجية، 57 (2) ، 434-450.
Boyaval ، P. ، Moineau ، S. ، Romero ، DA ، & Horvath ، P. (2007). يوفر كريسبر المقاومة المكتسبة ضد الفيروسات في بدائيات النوى. العلوم ، 315 (مارس) ، 1709-1713.
جودسيل ، د. (2002). المنظور الجزيئي: نوكليازات تقييدية. أساسيات الخلايا الجذعية في طب السرطان ، 20 ، 190-191.
هالفورد ، سي (2001). القفز والقفز والحلقة بواسطة إنزيمات التقييد. معاملات المجتمع البيوكيميائية ، 29 ، 363-373.
جيلتش ، أ. (2003). الحفاظ على هوية الأنواع والتحكم في أنواع البكتيريا: وظيفة جديدة لأنظمة التقييد / التعديل؟ الجين ، 317 ، 13-16.
كريبس ، ج. ، غولدشتاين ، إي ، وكيلباتريك ، س. (2018). جينات لوين XII (12 ed.). برلنغتون ، ماساتشوستس: جونز وبارتليت ليرنينج.
Li ، Y. ، Pan ، S. ، Zhang ، Y. ، Ren ، M. ، Feng ، M. ، Peng ، N. ،… She ، Q. (2015) تسخير أنظمة CRISPR-Cas من النوع الأول والثالث لتحرير الجينوم. بحوث الأحماض النووية ، 1-12.
Loenen و WAM و Dryden و DTF و Raleigh و EA و Wilson و GG (2013). النوع الأول من إنزيمات التقييد وأقاربهم. بحوث الأحماض النووية ، 1-25.
ناثانز ، د. ، وسميث ، هو (1975). نوكليازات مقيدة في تحليل وإعادة هيكلة جزيئات الحمض النووي. Annu. القس Biochem. ، 273 - 293.
Nei، M.، & Tajima، F. (1981). تعدد أشكال الحمض النووي يمكن اكتشافه عن طريق نوكليازات تقييدية. علم الوراثة ، 145-163.
Pingoud، A.، Fuxreiter، M.، Pingoud، V.، & Wende، W. (2005). علوم الحياة الخلوية والجزيئية من النوع الثاني نوكلياز تقييد: الهيكل والآلية. علوم الحياة الخلوية والجزيئية CMLS ، 62 ، 685-707.
روبرتس ، ر. (2005). كيف أصبحت إنزيمات التقييد هي حصيلة عمل البيولوجيا الجزيئية. PNAS، 102 (17) ، 5905-5908.
روبرتس ، آر جيه ، وموراي ، ك. (1976). نوكليازات تقييدية. مراجعات نقدية في الكيمياء الحيوية ، (نوفمبر) ، 123-164.
ستودارد ، بل (2005). هيكل ووظيفة نوكلياز داخلي. المراجعات الفصلية للفيزياء الحيوية ، 1–47.
توك ، إم آر ، ودريدين ، DTF (2005). بيولوجيا التقييد ومناهضة التقييد. الرأي الحالي في علم الأحياء الدقيقة ، 8 ، 466-472.
ويلسون ، جي جي ، وموراي ، نبراسكا (1991). أنظمة التقييد والتعديل. Annu. القس جينيه. ، 25 ، 585-627.
Wu، Z.، & Mou، K. (2016). رؤى جينومية في فوعة العطيفة الصائمية وعلم الوراثة السكانية. انفك. ديس. ترجمة. متوسط ، 2 (3) ، 109-119.
يوان ، ر. (1981). هيكل وآلية نوكليازات تقييدية متعددة الوظائف. Annu. القس Biochem. ، 50 ، 285-315.

إنزيمات التقييد: وظائف وأنواع وأمثلة - مادة الاحياء - 2025