تسلسل الحمض النووي: ماكسام جيلبرت ، الطريقة والأمثلة - مادة الاحياء - 2026

في تسلسل الحمض النووي (حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين) هو إجراء في مختبرات البيولوجيا الجزيئية التي تتيح ل معرفة ترتيب النيوكليوتيدات في المادة الوراثية من الفائدة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضًا الكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي).

كانت هذه التقنية لا غنى عنها لتطوير العلوم البيولوجية. كما أنه قابل للتطبيق في مجالات المعرفة الأخرى - مثل التشخيص الطبي والتحقيقات الجنائية ، على سبيل المثال.

المصدر: pixabay.com

في السابق ، كان يعتبر تسلسل خيط DNA نشاطًا بطيئًا ومكلفًا ، مما سمح بتحديد عدد قليل من الأزواج الأساسية في قليلات النوكليوتيدات.

اليوم ، مع كل التطورات العلمية ، يعد تسلسل الحمض النووي عملية روتينية في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم بفضل مساهمة ما يقرب من 50 عامًا من البحث في هذا المجال. من حيث طول السلسلة ، يمكن تسلسل ما يصل إلى ملايين الأزواج الأساسية في وقت قصير جدًا.

للقيام بذلك ، هناك العشرات من التقنيات التي تم تطويرها والتي تختلف في السعر والدقة. في هذه المقالة ، سوف نصف التقنيات الكلاسيكية والحديثة ، ولكل منها مزاياها وعيوبها.

حتى الآن ، تسمح تقنيات التسلسل بالحصول على تسلسل الجينوم الكامل ، من بدائيات النوى الصغيرة والخمائر إلى الجينوم البشري.

هيكل الحمض النووي

لفهم الأساليب والتقنيات المستخدمة في تسلسل الحمض النووي ، من الضروري معرفة بعض الجوانب الرئيسية لبنية الجزيء وتكوينه.

الحمض النووي هو جزيء حيوي موجود في جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى الحيوانات المائية الكبيرة. تحتوي العضيات - مثل الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء - على جزيء دنا دائري بداخلها. حتى في بعض الفيروسات ، فإن المادة الجينية الموجودة هي الحمض النووي.

من الناحية الهيكلية ، الحمض النووي عبارة عن مجموعة من النيوكليوتيدات. يتكون كل منها من كربوهيدرات وقاعدة نيتروجينية (A أو T أو C أو G) ومجموعة فوسفات. الهدف من تسلسل الحمض النووي هو الكشف عن الترتيب الذي توجد به القواعد النيتروجينية الأربعة في التسلسل.

التاريخ

في منتصف الخمسينيات من القرن الماضي ، وصف الباحثان واتسون وكريك بنية الحمض النووي باستخدام تقنيات التصوير المسيحي. ومع ذلك ، لم يتمكن أي من هؤلاء الباحثين من إيجاد طريقة لكشف التسلسل.

على الرغم من وجود أسلاف معينين ، كان الحدث الأكثر أهمية هو إنشاء طريقة سانجر في عام 1977. كان فريدريك سانجر ، مؤسس هذه الطريقة ، عالم كيمياء حيوية بريطانيًا ، وفاز بجائزتي نوبل لإسهاماته الهائلة في العلوم البيولوجية.

تُعرف هذه التقنية أيضًا في الأدبيات باسم "إنهاء السلسلة" أو dideoxynucleotides. سيتم وصف مبادئ هذه التقنية وتلك التي تم تطويرها بناءً على تحسينها وابتكارها أدناه.

طريقة سانجر

يمثل تطوير طريقة سانجر حدثًا حاسمًا في علم الأحياء الجزيئي. يتضمن المكونات الأساسية لعملية تكرار الحمض النووي التي تحدث عادة في الخلية ، ولكن مع إضافة مكون خاص: ديديوكسينوكليوتيدات.

المكونات الرئيسية للتفاعل

- بوليميراز الدنا: إنزيم بوليميراز الدنا عنصر حاسم في العملية. يشارك هذا الجزيء في تكرار خيط الحمض النووي ويتمثل دوره في تخليق الخيط الجديد ، وإقران ثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوتيدات مع التكميلية.

تذكر أنه في الحمض النووي ، يتزاوج الثايمين (T) مع الأدينين (A) من خلال رابطتين هيدروجينيتين ، بينما السيتوزين (C) يفعل ذلك مع الجوانين (G) من خلال ثلاث روابط.

- النيوكليوتيدات: يتضمن تسلسل سانجر نوعين من النيوكليوتيدات ، أربعة 2'-deoxynucleotides (مختصرة كـ dATP ، dGTP ، dCTP و dTTP) وأربعة ديوكسينوكليوتيدات (ddATP ، ddGTP ، ddCTP و ddTTP).

على الرغم من أن ثنائي أكسيد النوكليوتيدات يشبه المونومرات التي يتم دمجها عادة في الحمض النووي ، إلا أنها تفتقر إلى مجموعة -OH في بنيتها. هذا يجعل من المستحيل إضافة نيوكليوتيد جديد إلى السلسلة.

لذلك ، عندما يضاف نوكليوتيد خاص - بطريقة عشوائية تمامًا - إلى السلسلة في التكوين ، يصاب التخليق بالشلل. وهكذا ، في نهاية التفاعل ، توجد سلاسل ذات أحجام مختلفة ، كل منها توقف التفاعل عند نقطة مختلفة.

تجريبيا ، تم إعداد أربعة اختبارات. يحتوي كل منها على الحمض النووي المستخرج من العينة البيولوجية المعنية ، والنيوكليوتيدات الطبيعية ، وواحد من أنواع النوكليوتيدات الأربعة الخاصة. يتم تمييز النيوكليوتيدات الخاصة بنوع من العلامات الفلورية (انظر التسلسل الآلي أدناه).

قراءة النتائج

تتمثل الخطوة الأولى في فصل كل سلسلة من السلاسل المركبة وفقًا لحجمها. سيكون بعضها أطول من البعض الآخر ، اعتمادًا على مكان دمج القواعد الخاصة.

هناك تقنيات بيوكيميائية مختلفة تسمح بفصل مكونات الخليط باستخدام الحجم كخاصية تمييزية. في طريقة سانغر ، يتم فصل السلاسل المختلفة بواسطة الرحلان الكهربائي. في المتغيرات الأكثر تعقيدًا لهذه التقنية ، يتم استخدام الرحلان الكهربائي الشعري.

وبالتالي ، فإن الخيوط الأطول تسافر أقل من المتغيرات الأقصر. يمر هذا النظام بعد ذلك عبر قارئ يتعرف على العلامة الموجودة في كل ديديوكسينوكليوتيد. بهذه الطريقة ، يمكن معرفة ترتيب التسلسل.

تقنية "الجيل الأول" هذه قادرة على قراءة أجزاء الحمض النووي التي لا يزيد حجمها عن 1 كيلو بايت. في الوقت الحاضر ، يتم استخدام طريقة Sanger في مختبرات مختلفة ، بشكل عام في المتغيرات الحديثة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدامه لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام أكثر التقنيات تعقيدًا - ولكن أقل دقة.

التسلسل التلقائي

عندما يكون التسلسل مطلوبًا على نطاق واسع ، يتم تسريع العملية من خلال الأتمتة. هذا هو نوع مختلف من طريقة إنهاء سلسلة Sanger ، حيث يتم تمييز الاشعال بمنتجات الفلورسنت من أجل التمييز بينها.

بعد ذلك ، يتم تشغيل منتج التفاعل في رحلان كهربائي - كل ذلك في مسار واحد. نظرًا لأن كل جزء يخرج من الجزء الأخير من الجل ، يتم التعرف عليه سريعًا من خلال وضع العلامات الفلورية ، مع وجود خطأ يحيط بـ 1٪.

تحتوي أكثر الأنظمة تطوراً على نظام يصل إلى 96 أنبوبًا شعريًا يتم إدارتها بواسطة كمبيوتر مقترن بإنسان آلي. أي أنه يمكن اختبار 96 عينة من الحمض النووي في وقت واحد. وبالتالي ، فإن العملية التي تنطوي على الرحلان الكهربائي وتحليل النتائج مؤتمتة بالكامل.

في يوم واحد ، يمكن لهذه الأنظمة تسلسل ما يصل إلى 550.000 قاعدة. أثناء العملية ، العمل البشري غير ضروري ، يستغرق الأمر حوالي 15 دقيقة فقط لبدء الطريقة.

تسلسل ماكسام جيلبرت

في نفس الوقت الذي نشر فيه سانجر عمله ، نجح باحثان يدعى آلان ماكسان ووالتر جيلبرت في تطوير طريقة أخرى للحصول على تسلسل الحمض النووي. اكتسبت الطريقة شعبية في ذلك الوقت ، ولكن تم استبدالها لاحقًا بتحسين طريقة سانجر.

على عكس طريقة سانجر ، لا يتضمن تسلسل ماكسان وجيلبرت (أو التسلسل الكيميائي ، كما هو معروف أيضًا) تفاعلات التهجين. تتكون المنهجية من وضع العلامات على العوامل التفاعلية في أحد طرفيها ، تليها عملية تنقية.

يكمن أحد الجوانب السلبية لهذه التقنية في تعقيدها الهائل وفي استخدام المواد الكيميائية التي تشكل خطورة على المستخدم. تحدث الانكسارات الكيميائية عن طريق تطبيق DMS وحمض الفورميك والهيدرازين والهيدرازين مع الأملاح.

معالجة

يبدأ البروتوكول بوضع العلامات على الطرف 5 'من الخيط بعلامة الفوسفور 32 ، ثم يحدث تعديل كيميائي لقاعدة النيتروجين ويتم فصله. أخيرًا ، يحدث انقسام المنطقة القاسية.

أولاً ، عليك تقصير السلسلة التي تريد تسلسلها إلى مقاطع أصغر. يتم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام إنزيمات التقييد ، والتي تؤدي إلى نهايات بارزة.

بعد ذلك ، يتم إجراء التفاعل باستخدام فوسفاتيز قلوي ، والغرض منه هو التخلص من مجموعة الفوسفات. وبالتالي ، يمكن استخدام كيناز متعدد النوكليوتيدات لأداء وضع العلامات.

السلسلة مشوهة (الخيوط مفتوحة). ثم يتم تطبيق المواد الكيميائية. تتم تفاعلات الانقسام هذه بطريقة خاضعة للرقابة ومن المعروف أنواع الروابط التي تكسر كل مادة كيميائية مطبقة.

قراءة النتائج

كما في طريقة سانجر ، تتضمن قراءة النتائج الفصل حسب حجم السلاسل التي تم الحصول عليها في نظام الرحلان الكهربائي. تسمح الأنظمة المكونة من بولي أكريلاميد بالحصول على دقة كافية للغاية لقراءة الجل.

التسلسل الشامل

يشتمل التسلسل الهائل على سلسلة من الأساليب الجديدة ، والمختصرة باسم NGS ، من "تسلسل الجيل التالي" باللغة الإنجليزية.

تتطلب الطرق المصنفة على أنها NGS خطوة سابقة لتضخيم الحمض النووي (فهي لا تعمل مع جزيء واحد). علاوة على ذلك ، تختلف المنصات المستخدمة على نطاق واسع. سيتم وصف مبادئ الطرق الأكثر شيوعًا أدناه:

بيروسيكينج

يتضمن مراقبة إطلاق بيروفوسفات ، والذي يحدث في كل مرة يضاف فيها نيوكليوتيد جديد إلى حبلا DNA. يقترن نظام من الإنزيمات ، بحيث يحدث انبعاث الضوء (الذي يمكن اكتشافه بواسطة الكاميرا) في كل مرة يتم فيها دمج نيوكليوتيد جديد.

تبدأ العملية بحضانة منفصلة لكل قاعدة نيتروجين للتحقق مما إذا كان هناك انبعاث ضوئي أم لا. يمكن أن يقرأ Pyrosequencing سلاسل طويلة ، لكن معدل الخطأ الموجود مرتفع.

تسلسل التوليف

يتضمن هذا دمج النيوكليوتيدات المسمى. تتم إضافة هذه المكونات الفلورية ، وغسلها ، ويلاحظ النيوكليوتيد المدمج. بعد ذلك ، تتم إزالة ملصق النوكليوتيدات ، ويمكن أن يستمر تركيب الخيط. في الخطوة التالية ، سيتم أيضًا دمج نوكليوتيد مسمى ، وسيتم تكرار الخطوات المذكورة أعلاه.

يحدث عيب في هذه التقنية عندما لا يتم إزالة علامات الفلورسنت بالكامل. تخلق هذه الانبعاثات أخطاء في الخلفية ، مما يؤدي إلى أخطاء كبيرة.

تسلسل الربط

تختلف هذه التقنية عن غيرها ، لأنها لا تستخدم بوليميراز الحمض النووي. بدلاً من ذلك ، فإن الإنزيم الرئيسي لهذه المنهجية هو ligase. هنا ، يتم استخدام شظايا الحمض النووي ذات العلامات الفلورية ، وهي مرتبطة بالإنزيم ويتم اكتشافها.

أكبر مشكلة في هذه التقنية هي طول الجزء القصير الذي يمكن معالجته.

تسلسل أيون سيل

تعتمد هذه التقنية على قياس أيون H ⁺ الذي يتم إطلاقه في كل مرة يتم فيها دمج نيوكليوتيد جديد. المبدأ مشابه تمامًا للتسلسل الحراري ، ولكنه أرخص بكثير.

أمثلة

تسلسل الجينوم البشري

يعد تسلسل الجينوم البشري أحد أكثر التحديات الواعدة في علم الأحياء ، فضلاً عن كونه أحد أكثر المنافسات شهرة في تاريخ العلم. في الواقع ، بالنسبة للعلماء المشاركين في المشروع ، أصبح تسلسل الجينوم منافسة.

في عام 1990 بدأ ما أطلق عليه "مشروع الجينوم البشري" بقيادة العالم الشهير جيمس واتسون الحائز على جائزة نوبل. بعد عام ، في عام 1991 ، واجه فينتر التحدي المتمثل في "هزيمة" واتسون وتسلسل الجينوم أمامه. ومع ذلك ، في عام 1992 ، تقاعد واطسون وتولى باحث آخر الأمر.

في عام 1995 ، أعلن فنتر نجاحه في التسلسل الكامل للجينوم البكتيري بطريقة التسلسل العشوائي. وبالمثل ، أعلن الفريق المنافس بعد عام عن تسلسل جينوم الخميرة.

في عام 2000 ، تم إنهاء الدرجة. نشرت كلتا الشركتين نتائج الجينوم الأولية الكاملة في اثنتين من أكثر المجلات العلمية شهرة: Nature and Science.

ومع ذلك ، واصل العلماء العمل على تحسين المقترحات ، وفي عام 2006 تم الانتهاء من تسلسل بعض الكروموسومات البشرية.

الأهمية والتطبيقات

تعتبر معرفة ترتيب النيوكليوتيدات لجزيء مهم مثل الحمض النووي أمرًا ذا قيمة لعلماء الأحياء والمهنيين ذوي الصلة. تحتوي هذه السلسلة من عديد النيوكليوتيدات على جميع المعلومات اللازمة لتطوير وصيانة جميع أشكال الحياة.

لهذه الأسباب ، فإن معرفة هذا التسلسل أمر ضروري للبحث البيولوجي. في الأساس ، يتيح التسلسل قياس إحدى أهم خصائص الأنظمة البيولوجية وتحديد الاختلافات بينها.

يتم استخدام التسلسل على نطاق واسع من قبل علماء التصنيف والأنظمة ، نظرًا لأن بعض تسلسلات الحمض النووي تسمح بوضع معايير لاستنتاج ما إذا كان كائنان ينتميان إلى نفس النوع أم لا ، بالإضافة إلى القدرة على اقتراح فرضيات حول العلاقات التطورية بينهما.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن لتسلسل الحمض النووي تطبيقات في الطب والتشخيص. على سبيل المثال ، هناك أنظمة غير مكلفة ويمكن الوصول إليها تتيح ، من خلال التسلسل ، تقييم الميل إلى الإصابة بأمراض معينة (مثل السرطان) باستخدام ما يسمى بتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs).

كما تم إثراء التحقيقات في النوع الجنائي والطب الشرعي بتقنيات التسلسل ، والتي يمكن استخدامها كدليل موثوق به على مشاركة فرد معين في جريمة.

المراجع

1. هيذر ، جي إم ، وتشاين ، بي (2016). تسلسل المتسلسلات: تاريخ تسلسل الحمض النووي. علم الجينوم، 107 (1) ، 1-8.
2. Koboldt ، DC ، Steinberg ، KM ، Larson ، DE ، Wilson ، RK ، & Mardis ، ER (2013). ثورة الجيل القادم في التسلسل وتأثيرها على علم الجينوم. الخلية ، 155 (1) ، 27-38.
3. ليفي ، ج. (2010). المنافسات العلمية. من جاليليو إلى مشروع الجينوم البشري. افتتاحية Paraninfo.
4. سانجر ، إف ، نيكلين ، س. ، وكولسون ، أر (1977). تسلسل الحمض النووي مع مثبطات إنهاء السلسلة. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم ، 74 (12) ، 5463-5467.
5. شوستر ، SC (2007). تسلسل الجيل التالي يغير علم الأحياء اليوم. طرق الطبيعة ، 5 (1) ، 16.
6. شو ، ج. (محرر). (2014). تسلسل الجيل القادم. Caister Academic Press.