تلطيخ البوغ: الأساس المنطقي والتقنيات والاستخدامات - مادة الاحياء - 2025

و تلطيخ بوغ هو المنهجية المستخدمة لتلوين الهياكل المقاومة التي تشكل بعض الأجناس البكتيرية عندما تكون في ظروف غير مواتية. هذه الهياكل تتوافق مع شكل من أشكال البقاء.

هناك العديد من الأجناس التي تشكل الأبواغ. ومع ذلك ، فإن أهمها هي Bacillus و Clostridium. تعتبر هذه الأجناس أكثر صلة لأن لها أنواعًا ممرضة للإنسان.

تلطيخ الأبواغ بواسطة طريقة Shaeffer - Fulton أو Wirtz-Conklin. و tambe (رافع أصلي) ، من ويكيميديا ​​كومنز

يمكن أن تؤدي كل عصية إلى ظهور بوغ. في وقت تلطيخ المستحضر ، يمكن العثور على البوغ داخل العصية (endospore) أو خارجه (exospore). مع تقنيات التلوين التقليدية للبكتيريا - مثل صبغة جرام - تظل الجراثيم عديمة اللون.

حاليًا ، هناك العديد من منهجيات التلوين القادرة على اختراق البنية السميكة للجراثيم لصبغها. هذه المنهجيات متنوعة للغاية ؛ وتشمل هذه تقنية Dorner وصمة عار Möeller ومنهجية Shaeffer - Fulton ، والمعروفة أيضًا باسم Wirtz-Conklin.

من بين جميع التقنيات المذكورة ، فإن منهجية Shaeffer-Fulton هي الأكثر استخدامًا في المختبرات الروتينية. سمي على اسم اثنين من علماء الأحياء المجهرية الذين ابتكروا التلوين في عام 1930: أليسيا شيفر وماكدونالد فولتون. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تسمى أحيانًا Wirtz-Conklin على اسم اثنين من علماء البكتيريا من القرن العشرين.

أساس

لا تلطخ الجراثيم البقع التقليدية لأن جدارها سميك للغاية. يمنع التركيب المعقد للجراثيم دخول معظم الملونات.

إذا تمت دراسة البوغ من الخارج إلى الداخل ، يتم ملاحظة الطبقات التالية: أولاً ، يوجد exosporium ، وهو أنحف وطبقة خارجية مكونة من البروتينات السكرية.

يأتي بعد ذلك الجلد الذي يوفر مقاومة لدرجات الحرارة المرتفعة ، تليها القشرة المكونة من الببتيدوغليكان. في وقت لاحق هو جدار القاعدة الذي يحمي البروتوبلاست.

الجراثيم عبارة عن بنية مجففة تحتوي على 15٪ كالسيوم وحمض ديبيكولينك. لذلك ، تعتمد معظم تقنيات تلطيخ الأبواغ على تطبيق الحرارة بحيث يمكن للصبغة اختراق البنية السميكة.

بمجرد تلطيخ الجراثيم ، لا يمكنها إزالة الصبغة. في تقنية Shaeffer - Fulton ، يدخل أخضر الملاكيت إلى الخلايا الخضرية ، وعندما يتم تطبيق الحرارة ، يخترق الأبواغ الداخلية وكذلك exospores.

عن طريق الغسل بالماء ، تتم إزالة الصبغة من الخلية النباتية. يحدث هذا لأن صبغة الملكيت الخضراء أساسية قليلاً ، لذا فهي ترتبط بشكل ضعيف بالخلية النباتية.

بدلاً من ذلك ، لا يمكن أن تخرج من الجراثيم وفي النهاية تتم مقاومة العصيات بالسفرانين. هذا الأساس صالح لبقية التقنيات التي يحدث فيها شيء مشابه.

تقنيات تلطيخ الأبواغ

لإجراء تلطيخ الأبواغ ، يجب الحصول على ثقافة نقية للسلالة المشبوهة المراد دراستها.

تخضع المزرعة لدرجات حرارة شديدة لمدة 24 ساعة لتحفيز الكائنات الحية الدقيقة على التكاثر. لهذا ، يمكن وضع الثقافة في فرن عند 44 درجة مئوية أو في الثلاجة (8 درجات مئوية) لمدة 24 أو 48 ساعة.

إذا تركت لفترة طويلة في درجات الحرارة المذكورة ، فسيتم ملاحظة فقط exospores ، لأن جميع الإندوسبورات ستكون قد خرجت بالفعل من العصية.

في نهاية الوقت ، يجب وضع بضع قطرات من المحلول الفسيولوجي المعقم على شريحة نظيفة. ثم يتم أخذ جزء صغير من الثقافة وعمل انتشار جيد.

بعد ذلك ، يُترك ليجف ويُثبت في الحرارة ويُصبغ بإحدى التقنيات الموضحة أدناه:

تقنية دورنر

1- قم بإعداد معلق مركز للكائنات الحية الدقيقة المبوغة في الماء المقطر في أنبوب اختبار وأضف كمية متساوية من Kinyoun carbol fuchsin المصفى.

2- ضع الأنبوب في الحمام بالماء المغلي لمدة تتراوح بين 5 و 10 دقائق.

3- على شريحة نظيفة ، قم بخلط قطرة من المعلق السابق مع قطرة من محلول نيجروزين مائي 10٪ مغلي ومفلتر.

4- افرده وجففه بسرعة بالحرارة اللطيفة.

5- فحص بهدف 100X (غمر).

تلطخ الجراثيم باللون الأحمر وتظهر الخلايا البكتيرية عديمة اللون تقريبًا على خلفية رمادية داكنة.

تقنية Dorner المعدلة

1- يتم نشر معلق من الكائنات الحية الدقيقة المبوغة على شريحة وتثبيتها في الحرارة.

2- العينة مغطاة بشريط ورق ترشيح يضاف إليه carbol fuchsin. يتم تسخين الملون لمدة 5 إلى 7 دقائق بلهب موقد بنسن حتى يتم تكوين الأبخرة. ثم يتم إزالة الورق.

3- يغسل المستحضر بالماء ثم يجفف بورق ماص.

4- قم بتغطية اللطاخة بغشاء رقيق بنسبة 10٪ نيجروزين باستخدام شريحة ثانية لنشر النيجروزين أو إبرة.

يكون اللون الذي تأخذه الجراثيم والبكتيريا هو نفسه الموصوف في حالة التقنية الصناعية السابقة

Shaeffer - تقنية Fulton أو Wirtz-Conklin

1- قم بعمل مسحة دقيقة بتعليق الكائن الدقيق المبوغ على شريحة وتثبيتها على الحرارة.

2- قم بتغطية الشريحة بمحلول مائي أخضر مالاكيت 5٪ (يمكنك وضع ورق ترشيح على الشريحة).

3- قم بالتسخين فوق شعلة موقد بنسن لإخراج الأبخرة وإزالة اللهب. كرر العملية لمدة 6 إلى 10 دقائق. إذا تبخر المحلول الأخضر الملكيت كثيرًا أثناء الإجراء ، فيمكن إضافة المزيد.

4- قم بإزالة ورق الترشيح (إن وجد) واغسله بالماء.

5- قم بتغطية الشريحة بـ 0.5٪ سافرانين مائي لمدة 30 ثانية (بعض أنواع هذه التقنية تستخدم 0.1٪ سافرانين مائي وتترك لمدة 3 دقائق).

مع هذه التقنية ، تظهر الجراثيم خضراء وحمراء العصيات.

من عيوبها أن الأبواغ الداخلية للثقافات الشابة لا تلطخ جيدًا ، لأنها تبدو واضحة للغاية أو عديمة اللون. لتجنب ذلك ، يوصى باستخدام مزارع لمدة 48 ساعة من الحضانة.

تقنية مولر

1- قم بتغطية اللطاخة بالكلوروفورم لمدة دقيقتين.

2- تخلص من الكلوروفورم.

3- غطيه بحمض الكروميك 5٪ لمدة 5 دقائق.

4- يغسل بالماء المقطر

5- الصفيحة مغطاة بكاربول فوشين-فينيكادا وهي معرضة لهب موقد بنسن حتى انبعاث أبخرة ؛ ثم يتم إزالته من اللهب لحظات قليلة. تتكرر العملية حتى اكتمال 10 دقائق.

6- يغسل بالماء.

7- استخدم الإيثانول المحمض (كحول هيدروكلوريك) لتغيير اللون. يُترك لمدة 20 أو 30 ثانية.

8- يغسل بالماء المقطر.

9- تباين بتغطية الورقة بأزرق الميثيلين لمدة 5 دقائق.

10- يغسل بالماء المقطر.

11- دعها تجف وتؤخذ العينة إلى المجهر.

تظهر الجراثيم باللون الأحمر والأزرق العصي. من المهم عدم استنشاق الأبخرة لأنها سامة ويمكن أن تكون مسببة للسرطان على المدى الطويل.

تقنية مولر المعدلة بدون حرارة

في عام 2007 ، ابتكر Hayama ومعاونوه تعديلًا لتقنية Möeller. قاموا بإلغاء خطوة تسخين الصبغة واستبدالها بإضافة قطرتين من الفاعل بالسطح Tergitol 7 لكل 10 مل من محلول carbol fuchsin-carbol. تم الحصول على نفس النتائج.

التطبيقات

يوفر تلوين الجراثيم معلومات قيمة ومفيدة للغاية لتحديد العامل الممرض ، نظرًا لوجودها وشكلها وموقعها داخل العصية والقدرة على تشويه الخلية النباتية أم لا ، فهي بيانات يمكن أن توجه الأنواع ضمن نوع معين.

في هذا السياق ، تجدر الإشارة إلى أن الجراثيم يمكن أن تكون مستديرة أو بيضاوية ، ويمكن أن تكون موجودة في المركز أو أيضًا في موضع جانبي أو تحت أو طرفي.

رسم تخطيطي لشكل وموقع endospores و exospores

أمثلة

- تشكل المطثية العسيرة بوغًا بيضاويًا في موضع طرفي يشوه العصيات.

- إن بوغ كلوستريديوم تيرتيوم بيضاوي ، لا يشوه العصيات ويقع في المستوى النهائي.

- إن بوغ المطثية الكزازية طرفية وتشوه العصيات ، مما يعطي مظهر أفخاذ.

- تكون جراثيم كلوستريديوم بوتولينوم ، المطثية الوشيقية ، والمطثية النسيجة ، والمطثية العظمية ، والمطثية العسيرة دائرية أو بيضاوية تحت الطبقة وتشوه العصيات.

- يقع endospore من Clostridium sordelli في الموضع المركزي ، مع تشوه طفيف.

Koneman E ، Allen S ، Janda W ، Schreckenberger P ، Winn W. (2004). التشخيص الميكروبيولوجي. (الطبعة الخامسة). الأرجنتين ، الافتتاحية Panamericana SA

المراجع

1. Hayama M ، Oana K ، Kozakai T ، Umeda S ، Fujimoto J ، Ota H ، Kawakami Y. اقتراح لتقنية مبسطة لتلطيخ الأبواغ البكتيرية دون استخدام الحرارة - تعديل ناجح لطريقة مولر. Eur J Med Res.2007 ؛ 16 12 (8): 356-9.
2. المساهمين في ويكيبيديا. صبغة مولر. ويكيبيديا، الموسوعة الحرة. 3 نوفمبر 2018 الساعة 03:28 بالتوقيت العالمي المنسق. متاح على: en.wikipedia.org
3. Pérez R ، Juárez M ، Rodríguez (2011). دليل معمل التقنيات الميكروبيولوجية. قسم العلوم الأساسية بأكاديمية علم الأحياء الدقيقة. المعهد الوطني للفنون التطبيقية.
4. "إندوسبور". ويكيبيديا، الموسوعة الحرة. 25 فبراير 2018 ، الساعة 10:20 بالتوقيت العالمي المنسق. 10 يناير 2019، 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L و Silva C و Fernández N و Bueno C و Torres J و Rico M و Macías J والمتعاونون. (2006). العاملون في مجتمع إكستريمادورا المتمتع بالحكم الذاتي. جدول الأعمال المحدد المجلد الرابع. الافتتاحية MAD. إشبيلية - إسبانيا ، ص 211-212.
6. Silva M، García M، Corrales J، Ponce E. (2006). فني مختبر متخصص ، Galician Health Service (SERGAS). موضوع معين جدول الأعمال المجلد 2. التحرير MAD. إشبيلية - إسبانيا ، ص 79-80.
7. Koneman E ، Allen S ، Janda W ، Schreckenberger P ، Winn W. (2004). التشخيص الميكروبيولوجي. (الطبعة الخامسة). الأرجنتين ، الافتتاحية Panamericana SA
8. Forbes B، Sahm D، Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 إد. الأرجنتين. التحرير Panamericana SA