صبغة ZIEHL-NEELSEN: الأساس المنطقي والكواشف والتقنية - مادة الاحياء - 2026

يعتبر Ziehl-Neelsen تقنية تلوين للتعرف على الكائنات الحية الدقيقة المقاومة لحمض الكحول (ARA). يشير اسم إجراء علم الأحياء الدقيقة هذا إلى مؤلفيه: عالم البكتيريا فرانز زيل وعالم الأمراض فريدريش نيلسن.

هذه التقنية هي نوع من التلوين التفاضلي ، مما يعني استخدام أصباغ مختلفة من أجل خلق تباين بين الهياكل التي تريد مراقبتها والتمييز بينها وتحديدها لاحقًا. تستخدم صبغة Ziehl-Neelsen لتحديد أنواع معينة من الكائنات الحية الدقيقة.

صبغة Ziehl-Neelsen

بعض هذه الكائنات هي المتفطرات (على سبيل المثال ، المتفطرة السلية) ، nocardia (على سبيل المثال ، Nocardia sp.) ، وبعض الطفيليات وحيدة الخلية (على سبيل المثال ، Cryptosporidium parvum). يمكن تصنيف العديد من البكتيريا من خلال تقنية شائعة تسمى صبغة جرام.

ومع ذلك ، تتطلب بعض المجموعات البكتيرية طرقًا أخرى لتتمكن من التعرف عليها. تتطلب تقنيات مثل صبغة Ziehl-Neelsen مجموعات من الأصباغ بالحرارة لتثبيت الصبغة الأولى على جدار الخلية.

ثم تأتي عملية التبييض التي تتيح نتيجتين: مقاومة أو حساسية لتغير اللون بواسطة الأحماض والكحول.

أساس

يعتمد الأساس المنطقي لتقنية التلوين هذه على خصائص جدار الخلية لهذه الكائنات الحية الدقيقة. يتكون الجدار من نوع من الأحماض الدهنية تسمى الأحماض الفطرية. تتميز هذه بوجود سلاسل طويلة جدًا.

عندما يكون للأحماض الدهنية هياكل طويلة جدًا ، يمكنها الاحتفاظ بالأصباغ بسهولة أكبر. يصعب جدًا تلطيخ بعض الأجناس البكتيرية بصبغة جرام ، نظرًا لارتفاع نسبة الأحماض الفطرية في جدار الخلية.

تستخدم صبغة Ziehl-Neelsen المركب الفينولي carbol fuchsin ، وهو صبغة أساسية. هذا لديه القدرة على التفاعل مع الأحماض الدهنية لجدار الخلية ، وهو شمعي في الملمس في درجة حرارة الغرفة.

يتم تحسين تلطيخ Carbol fuchsin في وجود الحرارة ، حيث يذوب الشمع وتتحرك جزيئات الصبغة بسرعة أكبر في جدار الخلية.

يعمل الحمض الذي يتم استخدامه لاحقًا على تلطيخ الخلايا التي لم يتم تلطيخها لأن جدارها لم يكن مرتبطًا بشكل كافٍ بالصباغ ؛ لذلك ، فإن قوة التبييض الحمضي قادرة على إزالة الصبغة الحمضية. تسمى الخلايا التي تقاوم هذا اللون بالحموضة السريعة.

تلوين ثانوي

بعد إزالة لون العينة ، تتناقض مع صبغة أخرى تسمى الصبغة الثانوية. بشكل عام ، يتم استخدام الميثيلين الأزرق أو الأخضر الملكيت.

تلطخ الصبغة الثانوية مادة الخلفية وبالتالي تخلق تباينًا مع الهياكل التي كانت ملطخة في الخطوة الأولى. تمتص الخلايا المتغيرة اللون فقط الصبغة الثانية (الصبغة المضادة) وتأخذ لونها ، بينما تحتفظ الخلايا سريعة التحمل باللون الأحمر.

كثيرا ما يستخدم هذا الإجراء لتحديد المتفطرة السلية والمتفطرة الجذامية ، والتي تسمى العصيات الحمضية السريعة.

الكواشف

تلوين أساسي

يستخدم 0.3٪ كاربول فوشسين (مصفى). يتم تحضير هذه الصبغة من خليط من الكحوليات: الفينول في الإيثانول (90٪) أو الميثانول (95٪) ، وفي هذا الخليط يتم إذابة 3 جرام من الفوكسين الأساسي.

محلول التبييض

في هذه الخطوة ، يمكن استخدام محاليل 3٪ حمض كحول أو 25٪ حمض كبريتيك.

صبغة ثانوية (صبغة مضادة)

عادة ما تكون الصبغة الأكثر استخدامًا لمقارنة العينات هي 0.3٪ من الميثيلين الأزرق. ومع ذلك ، يمكن أيضًا استخدام البعض الآخر ، مثل 0.5 ٪ من الملكيت الأخضر.

تقنية

إجراء تلطيخ سريع الحمضية

تحضير مسحة بكتيرية

يتم التحضير على شريحة نظيفة وجافة ، مع اتباع احتياطات التعقيم.

تجفيف المسحة

اترك المسحة تجف في درجة حرارة الغرفة.

تسخين العينة

يجب تسخين العينة عن طريق إطلاق النار على الشريحة أدناه. يمكن إجراء التثبيت الكحولي عندما لا يتم تحضير اللطاخة بالبلغم (يتم معالجتها بهيبوكلوريت الصوديوم لتبييضها) وإذا لم تتلطخ على الفور.

يتم إزالة المتفطرة السلية مع التبييض وأثناء عملية التلوين. لن يؤدي التثبيت الحراري للبلغم غير المعالج إلى قتل المتفطرة السلية ، بينما التثبيت الكحولي مبيد للجراثيم.

قم بتغطية البقعة

البقعة مغطاة بمحلول carbol fuchsin (وصمة أساسية أولية).

سخني البقعة

يتم ذلك لمدة 5 دقائق. يجب أن تلاحظ تطور البخار (حوالي 60 درجة مئوية). من المهم عدم ارتفاع درجة حرارة العينة وتجنب حرقها.

فيما يتعلق بتسخين البقعة ، يجب توخي الحذر الشديد عند تسخين carbol fuchsin ، خاصةً إذا تم التلوين على صينية أو حاوية أخرى تم فيها جمع مواد كيميائية شديدة الاشتعال من التلوين السابق.

يجب وضع شعلة صغيرة فقط تحت الشرائح باستخدام ممسحة مضاءة مسبقًا مبللة ببضع قطرات من الكحول الحمضي أو الميثانول أو 70٪ من الإيثانول. تجنب استخدام ممسحة كبيرة مبللة بالإيثانول حيث قد يؤدي ذلك إلى نشوب حريق.

اغسل البقعة

يجب أن يتم هذا الغسيل بالماء النظيف. إذا لم يكن ماء الصنبور نظيفًا ، يُفضل غسل اللطخة بالماء المقطر أو المصفى.

غطِ اللطاخة بالكحول الحمضي

يجب أن تكون نسبة الكحول الحمضي 3٪. تتم التغطية لمدة 5 دقائق أو حتى يتغير لون اللطاخة بدرجة كافية ، أي لون وردي باهت.

يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن الكحول الحمضي قابل للاشتعال ؛ لذلك ، يجب استخدامه بحذر شديد. تجنب الاقتراب من مصادر الاشتعال.

اغسل البقعة

يجب أن يكون الغسيل بالماء النظيف المقطر.

قم بتغطية اللطاخة بالبقعة

يمكن أن يكون لونه أخضر المالاكيت (0.5٪) أو أزرق الميثيلين (0.3٪) لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، وذلك باستخدام وقت أطول إذا كانت المسحة رقيقة.

اغسل البقعة

يجب استخدام الماء النظيف (المقطر) مرة أخرى.

لاستنزاف

يجب تنظيف الجزء الخلفي من الشريحة ووضع البقعة على رف تصريف للسماح لها بالجفاف في الهواء (لا تستخدم ورقًا ماصًا للتجفيف).

افحص المسحة تحت المجهر

يجب استخدام زيت الهدف 100X والغمر. امسح اللطاخة بشكل منهجي وسجل الملاحظات ذات الصلة.

فسر النتائج

نظريًا ، تعتبر الكائنات الحية الدقيقة التي تلطخ لونًا ضارب إلى الحمرة موجبة للحموضة (AAR +).

على العكس من ذلك ، إذا كانت الكائنات الحية الدقيقة تلطخ باللون الأزرق أو الأخضر ، اعتمادًا على الصبغة المستخدمة كصبغة مضادة ، فإنها تعتبر سالبة للحمض (AAR-).

المراجع

1. Apurba، S. & Sandhya، B. (2016). أساسيات علم الأحياء الدقيقة العملي (الطبعة الأولى). جايبي براذرز للنشر الطبي.
2. بومان ، ر. (2014). علم الأحياء الدقيقة مع الأمراض حسب نظام الجسم (الطبعة الرابعة). شركة Pearson Education، Inc.
3. هيريتيج ، جي ، إيفانز ، إي وكلينجتون ، إيه (1996) تمهيدية علم الأحياء الدقيقة (الطبعة الأولى). صحافة جامعة كامبرج.
4. موريلو ، ج. ، جراناتو ، ب.ويلسون ، إم ومورتون ، ف. (2006). دليل المختبر وكتاب العمل في علم الأحياء الدقيقة: تطبيقات لرعاية المرضى (الطبعة 11). تعليم ماكجرو هيل.
5. فاسانثاكوماري ، ر. (2007). كتاب علم الأحياء الدقيقة (الطبعة الأولى). منشورات BI PVT.