التألق المناعي: الأساس المنطقي والبروتوكول والتطبيقات - مادة الاحياء - 2026

و المناعي هي تقنية قوية المناعية باستخدام أجسام مضادة المستعبدين تساهميا إلى جزيئات الفلورسنت لتحديد أهداف محددة في عينات من الخلايا الثابتة على دعم قوي.

تتضمن هذه التقنية مراقبة مجهرية ذات خصوصية مناعية ، مما يجعل من الممكن مراقبة الخلايا الحية أو الميتة التي يمكن أن تقدم كميات ضئيلة من المستضدات. يستخدم على نطاق واسع في مجال البحث والتشخيص السريري لمختلف الأمراض.

الوسم المناعي لخيوط الأكتين في خلايا عضلة القلب (المصدر: Ps1415 عبر ويكيميديا ​​كومنز)

هذه التقنية ، النوعية بشكل أساسي (مع بعض المتغيرات الكمية) ، لها علاقة على وجه التحديد بتصور عينة من خلال إشارة منتج الفلوروفور ، وهو جزيء فلوري مرتبط بجسم مضاد وقادر على الإثارة عند طول موجي معين.

في السياق الخلوي ، من المفيد جدًا دراسة وجود / غياب وموقع الخلايا الفرعية للبروتينات. تم استخدام هذه التقنية في البداية في الإعداد السريري لتشخيص الفيروسات مثل الأنفلونزا وبعد ذلك للعديد من الأمراض المعدية الأخرى.

إنها تقنية حساسة للغاية ، ومع معدات الفحص المجهري المناسبة ، يمكن أن يكون لها دقة جيدة جدًا. يتطلب ، من أجل ملاحظته ، استخدام مجاهر متحد البؤر أو epifluorescence.

ومع ذلك ، على الرغم من كونها شائعة جدًا ، إلا أنها يمكن أن تقدم بعض المشكلات المهمة فيما يتعلق بالحصول على مضان غير محدد ينتج عنه بعض "الضوضاء" في الخلفية ، والتي غالبًا ما تحد من القراءة المناسبة للنتائج.

أساس

يعتمد التألق المناعي على استغلال الظاهرة البيولوجية للتفاعل التفاعلي بين الجسم المضاد والمستضد. يتعلق الأمر على وجه التحديد بالتخيل أو الكشف عن هذا التفاعل عن طريق جزيئات الفلورسنت المثيرة لطول موجة معين.

الجسم المضاد هو بروتين غلوبولين مناعي يفرز من الخلايا البائية النشطة ، والذي يتم إنشاؤه بشكل خاص ضد مستضد ، والذي يمكن أن يرتبط به بألفة وخصوصية عالية. يستفيد التألق المناعي من الغلوبولين المناعي IgG ، والتي توجد قابلة للذوبان في مصل الدم.

الأجسام المضادة هي جزيئات تصل إلى 950 كيلو دالتون تتكون من سلسلتين قصيرتين (خفيفتين) وسلاسل ببتيد طويلة (ثقيلة) على شكل "Y". تنقسم كل من السلاسل الخفيفة والثقيلة إلى مجالين: متغير واحد قادر على التعرف على مولد الضد ، والآخر ثابت أو محفوظ ، وهو سمة لكل نوع.

يتم تعريف المستضدات وظيفيًا على أنها جزيئات يمكن التعرف عليها بواسطة الجسم المضاد وهي في الغالب بروتينات. عندما يتعرض حيوان لمستضد ، يتم تنشيط الخلايا الليمفاوية في الجهاز المناعي ، مما ينتج أجسامًا مضادة محددة ضده وتعمل كنظام دفاع.

قد يكون لمولد الضد ، مثل البروتين ، على سبيل المثال ، أكثر من حاتمة واحدة أو موقع التعرف بواسطة الجسم المضاد ، وبالتالي قد يحتوي مصل الحيوان المعرض لمولد ضد على أجسام مضادة متعددة النسيلة ضد مناطق مختلفة من نفس البروتين.

وبالتالي ، يستغل التألق المناعي قدرة الحيوان على إنتاج أجسام مضادة متعددة النسيلة ضد مستضد معين من أجل تنقيته ثم استخدامه لاحقًا لاكتشاف نفس المستضد في سياقات أخرى.

من بين الأصباغ أو الجزيئات الفلورية الأكثر استخدامًا لبعض تقنيات التألق المناعي فلورسين أيزوثيوسيانات (FITC) ورباعي ميثيل رودامين أيزوثيوسيانات -5 و 6 (TRITC) ، والعديد من السيانين مثل Cy2 و Cy3 و Cy5 و Cy7 والأصباغ المسماة Alexa Fluor® ، مثل Alexa Fluor®448.

بروتوكول

يختلف بروتوكول التألق المناعي اعتمادًا على العديد من العوامل ، ومع ذلك ، بشكل عام ، يشمل تسلسلًا خطيًا من الخطوات يتكون من:

• تحضير اللوحات والخلايا
• تثبيت العينات
• نفاذية
• المنع
• المناعة أو المناعة
• التجمع والمراقبة

-تجهيز

من العينات

سيعتمد تحضير العينات على طبيعتها ونوع الخبرة التي يتعين القيام بها. سيتم شرح أبسط حالة ، والتي تتضمن استخدام الخلايا المعلقة ، أدناه.

يجب أولاً فصل الخلايا المعلقة ، أي في وسط استزراع سائل ، عنها عن طريق الطرد المركزي ثم غسلها بمحلول منظم أو "عازل" متساوي ، مما يحافظ على سلامتها.

عادة ، يتم استخدام محلول ملحي للفوسفات يعرف باسم PBS ، حيث يتم إعادة تعليق الخلايا ويتم طرد هذا الخليط مرة أخرى للحصول على الخلايا الخالية من وسط الاستزراع ، والذي قد يحتوي على مواد متداخلة.

من ريش

يجب أيضًا تحضير الشرائح المستخدمة للمراقبة المجهرية ، حيث سيتم إصلاح الخلايا لاحقًا للعلاجات النهائية المقابلة ، بعناية.

يتم تغطيتها أو "تحسسها" بمحلول بولي ليسين ، وهو بوليمر صناعي يعمل بمثابة "غراء جزيئي" بين الخلايا والدعامة الصلبة ، وذلك بفضل التفاعل الكهروستاتيكي بين الشحنات الموجبة لمجموعاتها الأمينية و الشحنات السالبة على البروتينات التي تغلف الخلايا.

تثبيت العينات

تتكون هذه العملية من شل حركة البروتينات الموجودة داخل الخلية من أجل الحفاظ على مكانها المكاني سليمًا. يجب أن تكون الجزيئات المستخدمة قادرة على عبور جميع أنواع أغشية الخلايا وتشكيل شبكات مع البروتينات التساهمية.

يتم استخدام الفورمالديهايد والبارافورمالدهيد والغلوتارالدهيد وحتى الميثانول على نطاق واسع ، حيث يتم تحضين عينات الخلايا لفترة معينة ثم غسلها بمحلول منظم متماثل.

بعد تثبيت الخلايا ، يستمر لصقها بالأوراق التي سبق تحسسها باستخدام بولي ليسين.

نفاذية

اعتمادًا على نوع الاختبار الذي تم إجراؤه ، سيكون من الضروري تفريغ الخلايا قيد الدراسة أم لا. إذا كان المطلوب هو معرفة موقع أو وجود أو عدم وجود بروتين معين على سطح الخلية ، فلن تكون النفاذية ضرورية.

من ناحية أخرى ، إذا كنت تريد معرفة موقع البروتين داخل الخلية ، فإن النفاذية ضرورية وستتكون من احتضان العينات باستخدام Triton X-100 ، وهو منظف قادر على نفاذية أغشية الخلايا.

المنع

خطوة أساسية في جميع تقنيات المناعة هي الحجب. في هذه المرحلة من الإجراء ، يتكون الحجب من تغطية جميع المواقع بجزيئات بولي ليسين التي لم تلتصق بها الخلايا ، على الأوراق الحساسة. أي أنه يمنع أي اتحاد غير محدد.

عادةً ما يتم استخدام المحاليل التي تحتوي على ألبومين مصل الأبقار (BSA) في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني من أجل الحجب ويتم الحصول على أفضل النتائج كلما طالت مدة الحضانة باستخدام هذا المحلول. بعد كل خطوة ، بما في ذلك الحجب ، من الضروري غسل المحلول المتبقي.

المناعة أو المناعة

سيعتمد الإجراء المناعي أو المناعي بشكل أساسي على ما إذا كان التألق المناعي المباشر أو غير المباشر (انظر أدناه).

إذا كان تألقًا مناعيًا أوليًا أو مباشرًا ، فسيتم تحضين العينات بالأجسام المضادة المرغوبة ، والتي يجب أن تقترن بالأصباغ الفلورية. يتكون إجراء الحضانة من تخفيف الجسم المضاد في محلول يحتوي أيضًا على مساحة سطح الجسم ولكن بنسب أقل.

عندما تكون الحالة هي حالة التألق المناعي الثانوي أو غير المباشر ، يجب إجراء حضانتين متتاليتين. أولاً مع الأجسام المضادة المطلوبة ثم مع الأجسام المضادة القادرة على اكتشاف المناطق الثابتة من الغلوبولين المناعي الأولي. هذه الأجسام المضادة الثانوية هي التي ترتبط تساهميًا بالفلور.

هذه التقنية متعددة الاستخدامات للغاية ، مما يسمح بوضع العلامات المتزامنة لأكثر من مستضد واحد لكل عينة ، طالما أن هناك أجسامًا مضادة أولية مقترنة بمركبات فلورية مختلفة ، في حالة التألق المناعي المباشر.

من أجل وضع العلامات المتزامنة في الفلورة المناعية غير المباشرة ، من الضروري التأكد من أن كل جسم مضاد أولي يتم إنتاجه في حيوان مختلف ، بالإضافة إلى أن كل جسم مضاد ثانوي مقترن بحامل فلور مختلف.

مثل الحجب ، فإن الحضانة بالأجسام المضادة تعطي نتائج أفضل كلما طال وقت ذلك. بعد كل خطوة ، من الضروري غسل الأجسام المضادة الزائدة التي لم ترتبط بالعينات وفي التألق المناعي الثانوي من الضروري منعها قبل إضافة الجسم المضاد الثانوي.

تستخدم تقنيات معينة بقعًا أخرى لا تتعلق بالتلوين المناعي ، مثل تلطيخ الحمض النووي باستخدام حامض DAPI الفلوري.

التجمع والمراقبة

خلال فترة الحضانة النهائية مع الفلوروفور ، من الضروري أن تظل العينات في الظلام. للمراقبة تحت المجهر ، من الشائع استخدام بعض المواد للحفاظ على تألق الفلوروفور إلى جانب الأجسام المضادة.

أنواع

ملخص رسومي للتألق المناعي المباشر وغير المباشر (المصدر: Westhayl618 عبر ويكيميديا ​​كومنز)

التألق المناعي المباشر أو الأولي

يتعلق الأمر باكتشاف المستضدات من خلال استخدام الأجسام المضادة الفلورية. الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية هي سرعتها ، ومع ذلك ، يمكن أن تحدث العديد من حالات الارتباط غير المحدد في العملية ، خاصة عند دراسة الأمصال البشرية ، لأنها غنية بالأجسام المضادة غير المتجانسة للغاية.

التألق المناعي غير المباشر أو الثانوي

تُعرف أيضًا باسم تقنية "الشطيرة" وهذا يتضمن تطوير التقنية في خطوتين. الأول يتعلق باستخدام الجسم المضاد غير الفلوري وربطه بمولد الضد المعني.

مقابل المنطقة الثابتة لهذا الجسم المضاد الأول (الذي سيعمل الآن كمستضد) يتم استخدام جسم مضاد آخر قادر على التعرف عليه ، والذي يرتبط بجزيء الفلورسنت.

سيكون ظهور إشارة الفلورسنت نتيجة التعرف المحدد بين أول جسم مضاد غير فلوري ومولد الضد محل الاهتمام ؛ إن وجود هذا الجسم المضاد الأول يشترط وجود الجسم المضاد الثاني ، والذي تم تمييزه وبفضله يمكن تحديد وجود أو عدم وجود المستضد.

على الرغم من كونها تقنية تستغرق وقتًا طويلاً أكثر من تقنية التألق المناعي المباشر (لأنها تتضمن خطوة حضانة أخرى) ، إلا أن هذه التقنية لا تتضمن تصميم جسم مضاد فلوري لكل مستضد تمت دراسته ، مما ينتج عنه ، من الناحية الاقتصادية ، أكثر قابلية للحياة.

علاوة على ذلك ، إنها تقنية أكثر حساسية من حيث تضخيم الإشارة ، حيث يمكن أن يرتبط أكثر من جسم مضاد ثانوي بالمنطقة الثابتة من الجسم المضاد الأولي ، وبالتالي تضخيم شدة إشارة الفلورسنت.

التطبيقات

كما لوحظ سابقًا ، فإن التألق المناعي هو أسلوب متعدد الاستخدامات للغاية ، وقد تم استخدامه بعدة طرق في المجالات العلمية والسريرية. يمكن استخدامه للإجابة على الأسئلة البيئية والجينية والفسيولوجية المتعلقة بالعديد من الكائنات الحية.

من بين التطبيقات السريرية ، يتم استخدامه للتشخيص المباشر لبعض الأمراض الجلدية ، إما باستخدام التألق المناعي المباشر أو غير المباشر على الأنسجة الظهارية للمرضى الخاضعين للدراسة.

كانت تقنيات التألق المناعي متاحة في الكائنات أحادية الخلية مثل الخميرة لتصور الأنابيب الدقيقة داخل النواة والسيتوبلازم ، والأكتين والبروتينات المرتبطة بها ، وخيوط 10 نانومتر ، ومكونات أخرى من السيتوبلازم والغشاء وجدران الخلية.

المراجع

1. Abcam ، بروتوكول الكيمياء المناعية والتألق المناعي. تم الاسترجاع من abcam.com
2. جريف ، سي (2012). الأصباغ الفلورية. تعافى من leica-microsystems.com
3. ميلر ، DM ، & Shakest ، DC (1995). الفحص المجهري المناعي. في طرق بيولوجيا الخلية (المجلد 48 ، ص 365 - 394). الصحافة الأكاديمية ، وشركة
4. Odell ، ID ، & Cook ، D. (2013). تقنيات التألق المناعي. مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية ، 133 ، 1-4.
5. برينكل ، BJR ، آدامز ، AEM ، Druain ، DG ، & Brian ، K. (1991). طرق التألق المناعي للخميرة. في طرق علم الإنزيمات (المجلد 194 ، ص 565-602). الصحافة الأكاديمية ، وشركة
6. Schaeffer، M.، Orsi، E.V، & Widelock، D. (1964). تطبيقات التألق المناعي في علم فيروسات الصحة العامة. المراجعات البكتريولوجية ، 28 (4) ، 402-408.
7. Vrieling ، EG ، & Anderson ، DM (1996). التألق المناعي في أبحاث العوالق النباتية: التطبيقات والإمكانيات. J: فيكول. ، 32 ، 1-16.