و بروتين K هو انزيم تنتمي إلى مجموعة من البروتياز سيرين، أي أنه يملك في منتصف النشطة حفاز سيرين الأحماض الأمينية ولها وظيفة من كسر السندات الببتيد من التحلل. بدوره ، ينتمي هذا الإنزيم إلى عائلة بروتينات السوبتيليزين (ببتيداز S8).
بروتيناز K له وزن جزيئي (MW) يبلغ 28900 دالتون وتم عزله لأول مرة في عام 1974 في مقتطفات من ألبوم Engyodontium للفطر ، المعروف سابقًا باسم Tritirachium Album Limber.
التركيب الجزيئي لـ Proteinase K. المصدر: Lykchiniadis
لديه قدرة عالية على التحلل البروتيني ، والتي تظهر من خلال قدرته على تحلل الكيراتين الموجود في الشعر. كلمة كيراتين في اللغة الإنجليزية مكتوبة "كيراتين" ، ومن هنا سميت "بروتيناز ك".
نظرًا لقدرته العالية على شطر البروتينات الأصلية ، فإن هذا الإنزيم مفيد في تقنيات البيولوجيا الجزيئية المختلفة. يتم استخدامه بشكل أساسي لعزل وتحضير الأحماض النووية ذات الوزن الجزيئي العالي (MW).
يعمل بروتيناز K عن طريق إطلاق الحمض النووي النووي ، مع تدمير البروتينات وإبطال نشاط RNases و DNases ، أي أنه يزيل نوكليازات في مستحضرات DNA و RNA.
من ناحية أخرى ، فقد لوحظ أن بروتيناز K يمكن أن يحلل بعض البروتينات الأصلية المشوهة ، الأمر الذي أثار اهتمام الباحثين لاستخدامه في دراسة بروتينات البريون (PrPC).
ومع ذلك ، على الرغم من قدرتها العالية على التحلل للبروتين ، إلا أن هناك بروتينات تقاوم عمل بروتيناز K. من بينها بعض البروتينات غير الطبيعية التي تسمى البريونات (PrPSc) ، المرتبطة بالاعتلال الدماغي الإسفنجي القابل للانتقال.
خصائص بروتين K
يحتوي بروتيناز K على بنية ثلاثية مكونة من ثلاث طبقات ، مع طبقة من سبع سلاسل متداخلة بين طبقتين من الحلزونات. نظرًا لأنه ينتمي إلى عائلة S8 من peptidases ، فإنه يتميز بوجود ثالوث محفز في موقعه النشط ، والذي يكون ترتيبها التسلسلي (Asp ، His and Ser) ، والذي يميزها عن العائلات الأخرى من peptidases.
يتميز هذا الإنزيم من مجموعة سيرين بروتياز بالتحلل المائي للروابط الببتيدية القريبة من المجموعة الكربوكسيلية للأحماض الأمينية الأليفاتية والعطرية.
من ناحية أخرى ، فهو قادر على العمل في وجود بعض المواد المسببة للتآكل ، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، و Tris-HCL و EDTA ، والتي تستخدم للمساعدة في تمسخ البروتينات ، مما يجعلها تفقد بنيتها الأصلية.
هذه خطوة أولية في تحضير البروتينات لتقنية الرحلان الكهربائي. نطاق الأس الهيدروجيني الذي يعمل عنده بروتيناز K واسع جدًا (2.0 إلى 12.0) ، مع درجة حموضة مثالية بين 7.5 إلى 12.0 ، ونقطة تساوي الكهرباء هي 8.9. كما يمكن رؤيته ، فهو نشط ضد نطاق واسع جدًا من الأس الهيدروجيني.
ومن الخصائص الأخرى التي تبرز في بروتيناز K ثباته في وجود درجات حرارة عالية (50-60 درجة مئوية).
النشاط الأنزيمي
يتطلب بروتين K وجود أيون الكالسيوم ، على الرغم من أن هذا لا يؤثر على نشاطه ، إذا كان ضروريًا للحفاظ على استقراره.
لكي يتمكن بروتيناز K من هضم الركيزة تمامًا ، من الضروري وجود وقت ملامس من حوالي 5 دقائق إلى ساعتين.
ومع ذلك ، بهذا المعنى ، قارن دازا وزملاؤه نقاء الحمض النووي الذي تم الحصول عليه في أوقات مختلفة من التعرض لبروتينيز ك ، وخلصوا إلى أن الحضانة المطولة (حتى 24 ساعة) تحسن جودة الحمض النووي بشكل كبير.
ومع ذلك ، فيما يتعلق بتركيز إنزيم بروتيناز K المستخدم في البروتوكولات المختلفة ، يمكن القول أنه متنوع للغاية.
يمكن استخدامه من تركيزات منخفضة جدا (5 ميكروغرام / مل) لتركيزات 500 ميكروغرام / مل. لكن تركيزات العمل الأكثر شيوعًا تتراوح من 50-100 ميكروغرام / مل ، خاصةً لهضم البروتين وتعطيل نوكلياز. على الرغم من أن علاج الأنسجة يتطلب تركيز 2 مجم / مل.
التطبيقات
تطبيقاته واسعة جدًا ويمكن تلخيصها على النحو التالي:
- يستخدم في هضم البروتينات واستخراج الحمض النووي بطرق مختلفة مثل: التمليح ، PK-SDS ، سيتيل تراي ميثيل بروميد الأمونيوم (CTAB) ، أسيتات البوتاسيوم المعدلة والاستخلاص باستخدام يوديد الصوديوم.
-تعطيل نوكليازات (RNases و DNases).
- في تقنية التهجين الموضعي (HIS) ، للمساعدة في إطلاق الحمض النووي ، بالإضافة إلى القضاء على البروتينات غير المرغوب فيها.
- تعديل البروتينات.
- على مستوى البحث في دراسات مختلفة.
مزايا بروتيناز ك
تم إجراء العديد من الدراسات المقارنة بين تقنيات استخلاص الحمض النووي التي تستخدم بروتين K ، مع تقنيات أخرى لا تستخدمه ، وخلصت جميعها إلى أن هناك فوائد أكبر عند استخدام الإنزيم. تشمل المزايا ما يلي:
- يتم الحصول على الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي العالي والجودة العالية والنقاء.
- الحمض النووي المستخرج مستقر لمدة تصل إلى 3 أشهر.
يمكن استخدام الحمض النووي المستخرج في التقنيات التالية: اللطخة الجنوبية ، تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، الرحلان الكهربائي ، من بين أمور أخرى.
بروتينات مقاومة بروتين ك
خلصت التحقيقات المختلفة إلى أن البريونات (بروتينات PrPSc السامة غير الطبيعية) تختلف عن بروتينات PrPC (الأصلية) من خلال مقاومتها لعمل بروتيناز K ، في حين أن PrPCs حساسة لعملها.
وصف مؤلفون آخرون أنه في بنية PrPSc توجد أجزاء حساسة وأخرى مقاومة للبروتيناز K. ومع ذلك ، فإن كلا الجزأين سامان ومعديان على حد سواء.
من ناحية أخرى ، قام باستيان وزملاؤه في عام 1987 بعزل 4 بروتينات بوزن 28 و 30 و 66 و 76 كيلو دالتون من نوع من Spiroplasma mirum. تم العثور على جميعها مقاومة لتأثير بروتيناز K ولديها أيضًا تفاعل متقاطع مع بعض البريونات.
من المعروف أن هذا النوع يمكن أن يسبب إعتام عدسة العين وأضرارًا عصبية مهمة ، وبسبب النتائج العلمية التي توصل إليها باستيان ، من بين التحقيقات الأخرى ، تم إجراء محاولة لربط هذا الكائن الدقيق بالاعتلال الدماغي الإسفنجي القابل للانتقال.
ومع ذلك ، فإن مسببات هذا المرض العصبي التنكسي لا تزال تُعزى إلى البريونات اليوم.
بهذا المعنى ، قام بتلر وزملاؤه في عام 1991 بتحديد وتمييز فئة من البروتينات المقاومة لبروتينيز K تبلغ 40 كيلو دالتون من سلالتين من الميكوبلازما هيورينيس. يؤثر هذا العامل الممرض على الخنازير ، ويصيب أنسجتها ، ولكن في هذه الحالة لم يكن هناك تفاعل متقاطع مع البريونات المختبرة.
مطلوب مزيد من البحث لتوضيح العديد من المجهول في هذا الصدد.
المراجع
- باستيان إف ، جينينغز آر ، وغاردنر دبليو 1987. يتفاعل المصل المضاد لبروتين ليفي المرتبط بالسكرابي مع بروتينات ليفي سبيروبلازما ميرو م. J. كلين. ميكروبيول. 25: 2430-2431.
- Daza C ، Guillen J ، Rey J ، Ruiz V. تقييم طريقة استخراج الحمض النووي وتنقيته من الأنسجة العضلية الثابتة بالفورمالديهايد لجثث مجهولة الهوية. مجلة ميد ، 2014 ؛ 22 (1): 42-49 ،
- Butler G و Kotani H و Kong L و Frick M و Evancho S و Stanbridge E و Mcgarrity G. تحديد وتوصيف البروتينات المقاومة للبروتيناز K في أعضاء صنف Mollicutes. العدوى والمناعة ، 1991 ، 59 (3): 1037-1042
- López M و Rivera M و Viettri M و Lares M و Morocoima A و Herrera L et al. مقارنة بين بروتوكولين لاستخراج الحمض النووي للمثقبيات الكروزية نمت في وسط ممحوض. القس بيرو. متوسط الصحة العامة 2014 ؛ 31 (2): 222-227. متاح على: scielo.org
- Jiménez G و Villalobos M و Jiménez E و Palma W. تحديد فعالية خمسة بروتوكولات لاستخراج الحمض النووي من مادة البارافين للدراسات الجزيئية. Rev Méd Univ كوستاريكا. 2007 ؛ 1 (1): 10-19.