اختبار أوكسيديز: الأساس المنطقي ، الإجراء ، والاستخدامات - مادة الاحياء - 2025

ل اختبار أوكسيداز هي طريقة التشخيص الذي يظهر وجود الانزيم معقدة تسمى السيتوكروم أوكسيديز ج. يحث هذا النظام على تحويل السيتوكروم المختزل إلى مؤكسد ، لأنه يلتقط الأكسجين وهذا بدوره يعمل كآخر متقبل للإلكترون (H ⁺) في السلسلة التنفسية.

مصطلح أوكسيديز هو طريقة مختصرة للإشارة إلى إنزيم أوكسيديز السيتوكروم ، المعروف أيضًا باسم إندوفينول أوكسيديز. في العصور القديمة ، كان يُعتقد أن إنزيمات السيتوكروم أوكسيديز والإندوفينول أوكسيديز هما إنزيمان مختلفان ، لكن من المعروف اليوم أنهما متماثلان.

اختبار أوكسيديز الموجب والسالب. المصدر: لم يتم تقديم مؤلف يمكن قراءته آليًا. Alpha.prim ~ commonswiki المفترض (بناءً على مطالبات حقوق النشر).

من جانبهم ، فإن السيتوكرومات هي بروتينات دموية تحتوي على الحديد وتكمل نظام أوكسيديز السيتوكروم. يمكن أن تختلف السيتوكرومات من نوع لآخر.

هناك أنواع مختلفة من السيتوكرومات (السيتوكرومات a1 و a2 و a3 و 0). يمكن لبعض البكتيريا أن تنتج نوعًا واحدًا فقط ، لكن البعض الآخر قد ينتج ما يصل إلى اثنين أو ثلاثة في المرة الواحدة. بهذا المعنى ، يُعرف وجود السيتوكروم أ و أ 3 باسم السيتوكروم أوكسيديز ج. هذا هو نوع السيتوكروم الذي يكتشفه اختبار أوكسيديز.

تحتوي أجناس النيسرية والزائفة على السيتوكروم أوكسيديز ج. تعطي هذه الأجناس اختبار أوكسيديز الإيجابي ، مما يساعد على تمييزها عن أجناس Acinetobacter و Stenotrophomonas على التوالي.

هناك أيضًا أجناس أخرى إيجابية أوكسيديز.

أساس

خصائص نظام السيتوكروم أوكسيديز ج

يعمل نظام السيتوكروم أوكسيديز ج بالطريقة التالية: تستخدم الكائنات الحية الدقيقة الموجبة لأكسيداز الأكسجين لتوليد الطاقة من خلال التنفس الهوائي. يعمل هذا النظام بفضل نقل الإلكترونات من المواد المانحة مثل NADH ⁺ إلى المواد المستقبلة ، في هذه الحالة الأكسجين.

ينتج عن هذا إنتاج الطاقة (ATP) والماء أو بيروكسيد الهيدروجين ، اعتمادًا على نظام أوكسيديز السيتوكروم الذي يمتلكه الكائن الدقيق.

هذا هو السبب في أن معظم البكتيريا الموجبة لأوكسيديز هي أيضًا إيجابية الكاتلاز ، وهي شرط ضروري للتخلص من بيروكسيد الهيدروجين الناتج ، لأن هذه المادة سامة للبكتيريا.

يوجد نظام سيتوكروم أوكسيديز ج في بعض البكتيريا الهوائية ، وبعض اللاهوائيات الاختيارية ، وعدد قليل من الكائنات الدقيقة ، ولا توجد لاهوائية صارمة. هذا الأخير مفهوم ، لأن اللاهوائية الصارمة لا يمكنها العيش في وجود الأكسجين ، وبالتالي فهي تفتقر إلى نظام أوكسيديز السيتوكروم.

مبدأ الاختبار

في هذا الاختبار ، يتم استخدام مواد تعمل كمستقبلات إلكترونية اصطناعية ، لتحل محل المواد الطبيعية داخل سلسلة نقل الإلكترون.

بشكل أساسي ، يتم استخدام أصباغ مثل بارافينيلين ديامين وإندوفينول ، والتي تعمل كركائز مستقبلية ومانحين إلكترونيين اصطناعيين.

يتأكسد بارافينيلين ديامين بواسطة نظام سيتوكروم أوكسيديز ج. تكون الصبغة في شكلها المصغر عديمة اللون ، ولكنها ملونة في شكلها المؤكسد.

هذه هي الطريقة التي يتضح بها وجود نظام السيتوكروم أوكسيديز ج ؛ حيث أن التفاعل الإيجابي سيولد لون خزامى أو أزرق أرجواني حسب الكاشف المستخدم.

من ناحية أخرى ، إذا كانت آخر مادة تقبل الإلكترون في السلسلة التنفسية مختلفة عن الأكسجين ، فسيكون اختبار أوكسيديز سالبًا (لا يوجد إنتاج لوني) ؛ هذا هو الحال مع الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية.

وبالمثل ، إذا كان السيتوكروم المستخدم من قبل الكائنات الحية الدقيقة مختلفًا عن السيتوكروم أوكسيديز ج ، فإنه سيعطي أيضًا الاختبار السلبي.

معالجة

هناك العديد من الكواشف والبروتوكولات لاختبار أوكسيديز ، وكلها لنفس الغرض.

الكواشف

كاشف كوفاكس ، كاشف جوردون وماكلويد ، كاشف نادي ، كاربنتر ، كاشف سورلاند وموريسون ، واستخدام أقراص أوكسيديز.

- كاشف أوكسيديز كوفاكس

وهي مكونة من 1٪ رباعي ميثيل-ف-فينيلين ديامين ثنائي هيدروكلوريد.

يتم تحضير كاشف Kovacs بإذابة 1 جرام من المادة المذكورة أعلاه في 50 مل من الماء المقطر. يتم تسخينه بمهارة حتى يذوب تمامًا. انقله إلى زجاجة كهرمانية ذات سعة كافية واجعل الحجم يصل إلى 100 مل بالماء المقطر. انتظر 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. يحفظ في ثلاجة محمية من الضوء.

يسمى كاشف أوكسيديز Kovacs ، لتمييزه عن كاشف Kovacs المستخدم للكشف عن اختبار الإندول. هذا الكاشف هو الأكثر حساسية وأقل سمية ولكنه أغلى من باقي الكواشف.

سيظهر رد فعل إيجابي مع هذا الكاشف مع تغير لون المستعمرة إلى الخزامى ، والذي يتحول بسرعة إلى اللون الأرجواني تقريبًا إلى الأسود. يكون رد الفعل السلبي واضحًا لأنه لا يوجد تغيير في اللون في المستعمرة أو أنه يأخذ لونًا ورديًا طفيفًا. يمكن للوسط أيضًا أن يغمق ، لكن هذا لا يعني رد فعل إيجابي.

مع هذا الكاشف ، يكون وقت التفاعل أمرًا بالغ الأهمية ، حيث يعتبر تغيير اللون الذي يحدث بين 5 إلى 15 ثانية رد فعل إيجابي.

- كاشف جوردون وماكلويد

وهو يتألف من ثنائي هيدروكلوريد ثنائي ميثيل-ف-فينيلين ديامين ، المعروف أيضًا باسم N-dimethyl-p-phenylenediamine أو p-aminodimethylaniline monohydrochloride. يتم تحضيره كما هو موصوف لكاشف أوكسيديز Kovacs ، ليحل محل المادة المعنية.

هذا الكاشف أكثر ثباتًا قليلاً من كاشف Kovacs أوكسيديز ، على الرغم من أن جميع الكواشف المحتوية على p-phenylenediamine غير مستقرة.

يتم تفسير هذا التفاعل لاحقًا على أنه إيجابي مع ظهور لون أزرق أرجواني في غضون 10 إلى 30 دقيقة.

- كاشف نادي

وهو يتألف من 1٪ ألفا نافثول في كحول الإيثيل (95٪ إيثانول) و 1٪ أمينوديميثيلانيلين. يحضر الخليط في أجزاء متساوية وباستخدام الكحول الإيثيلي المطلق كمادة مخففة ، حتى يتم تكوين كمية كافية لـ 100 مل.

- كاشف كاربنتر وسوهرلاند وموريسون

وهو يتألف من 1٪ أكسالات أمينوديميثيل ألانين. استعد بنفس الطريقة الموضحة لكاشف أوكسيديز Kovacs ، مع التغيير للمادة المقابلة.

مع المحلول الجاهز ، يتم تحضير شرائط الاختبار على النحو التالي: يتم تشريب شرائط ورق الترشيح Whatman No. 1 من 6-8 سم بكاشف أكسالات ثنائي ميثيل-ب- فينيلين ديامين 1٪.

يُسمح لها بالتجفيف دون ملامسة المعدن ، وتخزينها في برطمانات مغطاة ببراغي مع مادة مجففة وتخزينها في الثلاجة. هذه الشرائط ثابتة لمدة تصل إلى 6 أشهر.

إنه الكاشف الأكثر استقرارًا من بين كل تلك المذكورة ، ويمكن أن يستمر لمدة تصل إلى 6 أشهر في المحلول. نقطة إضافية أخرى هي أنه لا يلون الوسيط حول المستعمرة ، إذا تم استخدامه مباشرة على اللوحة.

يتم تفسير ظهور اللون الأحمر على أنه اختبار إيجابي.

- أقراص أوكسيداز

إنها أقراص تجارية مشربة بالكاشف لاختبار أوكسيديز. هناك العديد من العلامات التجارية في السوق.

استخدامه عملي للغاية ، لأنه ليس من الضروري تحضير كواشف جديدة ، مما يسهل العمل. النتائج التي تم الحصول عليها موثوقة طالما تم حفظ الأقراص بشكل صحيح.

البروتوكولات

طريقة اللوح المباشر والطريقة غير المباشرة على الورق واستخدام الأقراص المشبعة بكواشف أوكسيديز.

طريقة اللوحة المباشرة

يتم إضافة 2 أو 3 قطرات من أي من الكواشف المذكورة أعلاه لهذا الغرض مباشرة على المستعمرة (المستعمرات) الموجودة في لوحة وسط الثقافة التي لا تحتوي على الجلوكوز.

يتم تفسير تغيير أو عدم تغيير لون المستعمرات ، وليس الوسيط. يعتمد وقت التفاعل الصالح على الكاشف المستخدم.

- طريقة غير مباشرة على الورق

قم بقص قطعة من ورق الترشيح (Whatman No. 1) بحجم 6 سم ² وضعها داخل طبق بتري فارغ.

أضف 2 أو 3 قطرات من كاشف أوكسيديز Kovacs للورق ، خذ جزءًا من المستعمرة لتتم دراستها بمقبض بلاتيني أو عود أسنان خشبي وانشره في خط مستقيم على ورق مشبع بالكاشف. ترجم في غضون 5 إلى 10 ثوان.

مع تحضير الشرائط باستخدام كاشف كاربنتر وسوهرلاند وموريسون ، تنتشر المستعمرة على الشريط الجاف. يتم استخدام شريط واحد لاختبار عدة سلالات. فسر في غضون 10 ثوانٍ.

-أقراص (م

بلل الأقراص التجارية بمهارة بماء مقطر معقم وركبها على المستعمرة المراد دراستها. يوصى باستخدام الألواح عند 35 درجة مئوية ، إذا تم استخدام الألواح في درجة حرارة الغرفة أو ألواح التبريد ، يكون التفاعل أبطأ قليلاً. تفسير تغير اللون بين 10 إلى 20 ثانية.

يمكن استخدام المستعمرات الموجودة في الدم أو أجار الشوكولاتة.

- أقراص (طريقة غير مباشرة)

بلل القرص كما هو موضح سابقًا. ضعه في طبق بتري فارغ. خذ كمية كافية من المستعمرة للدراسة بمقبض بلاتيني أو عود أسنان خشبي وضعها على القرص. تفسير تغير اللون بين 10 إلى 20 ثانية.

استعمال

في بعض الأحيان يكون جنس النيسرية والبكتيريا الأسينية متشابهين للغاية من الناحية الشكلية لأنه على الرغم من أن جنس Acinetobacter هو قضيب سالب الجرام ، إلا أنه يمكن أن يتخذ في بعض الأحيان شكلاً كروكيًا ويتم توزيعه في أزواج ، محاكياً جنس النيسرية.

في هذه الحالة ، يكون اختبار أوكسيديز مفيدًا حقًا. جنس النيسرية إيجابي و Acinetobacter سلبي.

ومع ذلك ، فإن جنس Moraxella يشبه إلى حد بعيد جنس Neisseria وكلاهما يعطي رد فعل إيجابي ؛ هذا هو السبب في ضرورة إجراء اختبارات تخمير الكربوهيدرات دائمًا لتحديد الهوية بشكل نهائي.

من ناحية أخرى ، يعد اختبار أوكسيديز مفيدًا لتمييز البكتيريا التي تنتمي إلى عائلة Enterobacteriaceae (جميعها سلبية أوكسيديز) عن المخمرات الأخرى ، مثل جنس Pasteurella و Aeromonas و Plesiomonas (أوكسيديز إيجابي).

يعتبر جنس Vibrio و Helicobacter أيضًا موجبًا لأكسيداز.

سؤال وجواب

استخدام سلالات معروفة من الإشريكية القولونية كعنصر تحكم سلبي وسلالات من الزائفة الزنجارية كعنصر تحكم إيجابي.

محددات

- يجب استخدام الكواشف الطازجة ، وتكون مدة صلاحيتها في المحلول في درجة حرارة الغرفة قصيرة لأنها غير مستقرة للغاية. يمكن وضعها في الثلاجة لمدة تتراوح بين 5 أيام إلى أسبوعين.

- الكواشف عديمة اللون ، إذا تغير لونها يجب التخلص منها. تظهر الأقراص التالفة لأنها تصبح داكنة مع مرور الوقت.

- يعتبر التفاعل الإيجابي مع كاشف أوكسيديز Kovacs بين 15-60 ثانية تفاعلًا متأخرًا وبعد 60 ثانية يعتبر سالبًا.

- يعطي هيموفيليس إنفلونزا تفاعل أوكسيديز سلبي إذا تم استخدام أي كاشف مع ثنائي ميثيل-ب- فينيلنديامين ، ولكنه إيجابي إذا تم استخدام كاشف أوكسيديز كوفاك (رباعي ميثيل- ف- فينيلينديامين).

- المواد المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز تتداخل مع الاختبار وتعطي نتائج سلبية خاطئة.

- يمكن أن تعطي سلالات البورديتيلا السعال الديكي تفاعلًا إيجابيًا كاذبًا إذا جاءت من ألواح أجار الدم شديدة التركيز.

- يعطي استخدام المقابض المعدنية (الحديد) رد فعل إيجابي خاطئ.

التوصيات

- نظرًا لأن الكواشف غير مستقرة جدًا وتميل إلى الأكسدة الذاتية ، يوصى بتجميد أجزاء من 1 إلى 2 مل وإزالتها حسب الحاجة.

- طريقة أخرى لتأخير الأكسدة التلقائية للكاشف هي إضافة 0.1٪ حمض الأسكوربيك عند تحضير الكواشف.

- بما أن الكواشف غير مستقرة ، يوصى بمراقبة الجودة الأسبوعية.

- يجب عدم استخدام السندات التي لا تجتاز اختبار مراقبة الجودة.

المراجع

1. Koneman E ، Allen S ، Janda W ، Schreckenberger P ، Winn W. (2004). التشخيص الميكروبيولوجي. 5th إد. التحرير Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B، Sahm D، Weissfeld A. (2009). بيلي وسكوت التشخيص الميكروبيولوجي. 12 إد. التحرير Panamericana SA Argentina.
3. "اختبار أوكسيديز". ويكيبيديا، الموسوعة الحرة. 15 يناير 2018 ، الساعة 10:32 بالتوقيت العالمي المنسق. 3 أبريل 2019، 14:03
4. منظمة الصحة العالمية. دليل المختبر لتحديد واختبار القابلية لمضادات الميكروبات لمسببات الأمراض البكتيرية ذات الأهمية للصحة العامة في العالم النامي ، 2004. متاح على: who.int/drugresistance/infosharing
5. شرائط الكاشف لتشخيص نشاط أوكسيديز في البكتيريا. القس كوبانا ميد تروب. 2000 ؛ 52 (2): 150-151.