صبغة غرام: الأساس المنطقي والمواد والتقنية والاستخدامات - مادة الاحياء - 2026

ل صبغة جرام هي أبسط وأكثر فائدة تلطيخ التقنية في علم الأحياء الدقيقة التشخيصية. ابتكر هذه التقنية الطبيب الدنماركي هانز كريستيان غرام في عام 1884 ، والذي تمكن من تصنيف البكتيريا على أنها موجبة الجرام وسالبة الجرام ، وفقًا لتكوين جدار الخلية.

خضعت هذه التقنية لتعديلات معينة من قبل Hucker في عام 1921 لتثبيت الكواشف وتحسين جودة التلوين ، ولهذا السبب تُعرف صبغة غرام أيضًا باسم غرام-هاكر.

مسحات مختلفة ملطخة بصبغة جرام. أ.مكورات الجرام إيجابية. ب. قضبان سالبة الجرام. C. عصيات موجبة الجرام ، متعددة الأشكال وحيدة النواة. D. الخمائر.

من خلال هذه التقنية ، من الممكن أيضًا ملاحظة شكل الكائنات الحية الدقيقة ، أي إذا كانت مكورات ، عصيات ، عصيات ، متعددة الأشكال ، خيطية ، من بين أمور أخرى. بالإضافة إلى توزيعها في الفضاء: في كتلة ، في سلسلة ، معزولة ، في أزواج ، في رباعيات ، إلخ.

عند الاشتباه في وجود عدوى بكتيرية ، يجب تلطيخ معظم العينات المستلمة على شريحة وملطخة بالجرام للفحص المجهري.

سيوجه تقرير غرام الطبيب إلى نوع الكائنات الحية الدقيقة التي قد تكون سبب العدوى ، قبل الحصول على نتيجة الثقافة النهائية.

في بعض الحالات ، تكون حياة المريض في خطر شديد ، لذلك يحتاج الأطباء بشكل عاجل إلى تقرير غرام لوضع علاج تجريبي ، بينما ينتظرون تحديد الكائنات الحية الدقيقة.

على سبيل المثال ، إذا كشف الجرام عن وجود مكورات موجبة الجرام في السائل الدماغي النخاعي ، فسيوجه الطبيب العلاج الأولي بالمضادات الحيوية التي تقضي على هذا النوع من البكتيريا ، وفقًا للبروتوكولات الموضوعة لذلك.

بمجرد وصول النتيجة النهائية باسم الكائن الدقيق المعزول والمضاد الحيوي الخاص به ، سيقيم الطبيب ما إذا كان سيغير العلاج أم لا. سيتم اتخاذ هذا القرار وفقًا لدراسة مدى حساسية الكائن الدقيق للمضادات الحيوية التي يتلقاها وتطور المريض.

أساس

هذه تقنية لها 4 خطوات أساسية: التلوين ، والتثبيت بالحرارة ، وتغير اللون ، والبقعة المضادة. لذلك ، تسمح هذه التقنية ، بالإضافة إلى تلوين البكتيريا ، بالتمييز بينها.

الكريستال البنفسجي هو أول تلوين مستخدم. لديه تقارب مع الببتيدوغليكان وسوف يلطخ جميع البكتيريا الموجودة باللون الأرجواني ، وبعد ذلك يتم وضع اللوغول ، الذي يعمل بمثابة مادة لاذعة ، أي أنه سيحث على تكوين مجمعات اليود الكريستالية غير القابلة للذوبان - البروتينات النووية الريبية داخل الخلية..

البكتيريا موجبة الجرام ، التي لها جدار سميك من الببتيدوغليكان ، تشكل معقدات أكثر (الكريستال البنفسجي واليود) ، وبالتالي فإنها تحتفظ بالصبغة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يؤثر أيضًا على احتواء جدار البكتيريا موجبة الجرام على كمية أكبر من الأحماض غير المشبعة ، والتي تُظهر تقاربًا كبيرًا للعوامل المؤكسدة (لوغول).

وفي الوقت نفسه ، تحتوي البكتيريا سالبة الجرام على طبقة رقيقة من الببتيدوغليكان ، مما يجعل البكتيريا تشكل معقدات أقل من تلك إيجابية الجرام.

ثم تأتي خطوة تغيير اللون ، حيث تتصرف البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام بشكل مختلف.

تحتوي البكتيريا سالبة الجرام على غشاء خارجي غني بعديدات السكاريد الدهنية التي تشكل جزءًا من جدار الخلية. يتم تدمير الدهون عن طريق ملامسة كحول الأسيتون ، وبالتالي فإن الغشاء الخارجي يصبح غير مستقر ، ويطلق الكريستال البنفسجي.

هذه هي الطريقة التي يتم مواجهتها بعد ذلك بـ safranin أو fuchsin الأساسي ، وتحول إلى اللون الأحمر.

في حالة البكتيريا موجبة الجرام ، فإنها تقاوم التلاشي لأن المبيض يعمل عن طريق إغلاق المسام ، مما يمنع تسرب مركب اليود / البنفسجي الكريستالي.

لذلك ، يظل اللون البنفسجي الكريستالي ثابتًا ، ولا يوجد مكان للسافرانين أو الفوشسين. هذا هو سبب تلطيخ هذه البكتيريا باللون الأزرق أو الأرجواني.

المواد

تتكون مجموعة تلوين غرام من:

• زجاج بنفسجي
• لوغول
• كحول الأسيتون
• Safranin أو fuchsin الأساسي

تحضير الأصباغ والكواشف

محلول كريستال بنفسجي

الاجابه على:

الكريستال البنفسجي ------------- 2 غرام

الكحول الإيثيلي 95٪ 20 سم مكعب

الحل ب:

أكسالات الأمونيوم ----------- 0.8 غرام

ماء مقطر ------------- 80 سم مكعب

للتحضير النهائي للبنفسج الكريستالي ، يجب تخفيف المحلول A بنسبة 1:10 بالماء المقطر وخلطه مع 4 أجزاء من المحلول B. يتم تخزين الخليط لمدة 24 ساعة قبل الاستخدام. قم بالتصفية في زجاجة تلوين كهرماني باستخدام ورق الترشيح.

يتم نقل الكمية التي سيتم استخدامها يوميًا إلى زجاجة قطارة كهرمانية.

Iodo-Lugol

قم بوزن وقياس الكمية المحددة لكل مركب كما يلي:

بلورات اليود ------------- 1gr

يوديد البوتاسيوم ------------- 2gr

ماء مقطر 300 سم مكعب

يذوب يوديد البوتاسيوم شيئًا فشيئًا في الماء ثم يضاف اليود. حلق المحلول في زجاجة العنبر.

يتم نقل الكمية التي سيتم استخدامها يوميًا إلى زجاجة كهرمانية أصغر مع قطارة.

تبيض

95٪ كحول إيثيلي ----------- - 50 مل

الأسيتون ------------------ 50 مل

يتم تحضيره في أجزاء متساوية. قم بتغطيته جيدًا لأنه يميل إلى التبخر.

ضع في زجاجة قطارة.

يوفر هذا المستحضر تغيرًا في اللون في وقت معتدل من 5 إلى 10 ثوانٍ وهو الأكثر الموصى به.

يفضل المبتدئون استخدام كحول الإيثيل 95٪ فقط ، حيث يكون التلاشي أبطأ من 10 إلى 30 ثانية.

بينما يمكن للأشخاص الأكثر خبرة استخدام الأسيتون النقي ، حيث يحدث تغير اللون بسرعة كبيرة من 1 إلى 5 ثوانٍ.

التباين

محلول سهم سفرانين

سافرانينا ------------- 2.5 غرام

الكحول الإيثيلي 95٪ ---------- 100 سم مكعب

بعد وزن الكمية المحددة من السفرانين ، يذاب في 100 مل من 95٪ كحول إيثيلي.

يتم تحضير محلول safranin العامل من محلول المخزون.

للقيام بذلك ، قم بقياس 10 سم مكعب من محلول المخزون ، أضف 90 سم مكعب من الماء المقطر للحصول على 100 مل.

يوصى بنقل الكمية المراد استخدامها يوميًا إلى زجاجة كهرمانية بقطارة.

الكائنات الحية الدقيقة التي تلطخ بشكل ضعيف سالبة الجرام مع صبغة غرام-هاكر ، مثل بعض اللاهوائيات و Legionella sp و Campylobacter sp و Brucella sp ، يمكن تلطيخها بشكل أفضل باستخدام تعديل Kopeloff لوصمة Gram-Hucker ، تسمى صبغة جرام كوبيلوف.

هذه التقنية تغير صبغة السافرانين إلى الفوشسين الأساسي. مع هذا التعديل ، من الممكن تلوين الكائنات الحية الدقيقة المذكورة أعلاه بشكل فعال.

تخزين الكاشف

يجب تخزين الملونات المحضرة في درجة حرارة الغرفة.

تحضير مسحة العينة المراد تلوينها

يجب أن تحتوي العينة على ما لا يقل عن 10 ⁵ كائنات دقيقة قبل احتمال ملاحظة الكائن الدقيق في اللطاخة. يمكن عمل اللطاخات من العينة المباشرة أو من الثقافات في وسط صلب أو سائل.

يجب أن تكون المسحات موحدة وموزعة جيدًا وليست سميكة جدًا للحصول على رؤية أفضل للهياكل الموجودة.

-جرام العينات المباشرة

غرام بول غير منبوذ

يخلط البول ويوضع 10 ميكرولتر على شريحة. تشير ملاحظة حقل بكتيريا / غمس واحد على الأقل إلى وجود عدوى.

هذا يعني أن المزرعة ستحتوي على ما يقرب من 100000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) من البول في 85 ٪ من الحالات.

هذه الطريقة غير مفيدة للمستعمرات التي يقل عددها عن 100000 وحدة تشكيل مستعمرة.

CSF غرام

يجب طرد السائل النخاعي ، وإزالة المادة الطافية ، وانتشار الحبيبات على شريحة. هذا السائل معقم في ظل الظروف العادية ؛ ملاحظة البكتيريا تشير إلى الإصابة.

غرام عينات الجهاز التنفسي

إن غسل البلغم بالجرام أو القصبات الهوائية أو القصبات الهوائية ، على الرغم من أنه قد يكون هناك مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة ، سيوجه التشخيص دائمًا ، بالإضافة إلى كونه مفيدًا لنوع الخلايا التي تمت ملاحظتها.

في حالة البلغم ، يجب تحضير اللطاخة بأكثر الأجزاء تقيحًا في العينة.

غرام من البراز

لا يوصى بإجراء غرام على هذا النوع من العينات ، لأنه ليس له قيمة تشخيصية.

- جرام من المحاصيل

يمكن إجراؤها بطريقتين ، واحدة من الثقافات السائلة والأخرى من الثقافات الصلبة.

الثقافات السائلة

من الثقافات السائلة الأمر بسيط للغاية ؛ تؤخذ عدة تحميص من المرق الغائم تحت الموقد وتوضع على شريحة نظيفة وجافة ، مما يجعل حركات دائرية من المركز باتجاه المحيط لتوزيع المواد بالتساوي.

اتركه يجف تلقائيًا في الهواء. بمجرد أن تجف ، يتم تثبيت المادة على الصفيحة بالحرارة. للقيام بذلك ، بمساعدة الملقط ، يتم تمرير الورقة من 3 إلى 4 مرات من خلال شعلة موقد بنسن ، مع الحرص على عدم حرق المواد.

يُسمح للورقة بالتبريد وتوضع على جسر التلوين.

المحاصيل الصلبة

لإجراء مسحة لوصمة غرام من مزرعة صلبة ، اتبع ما يلي:

قبل اختيار المستعمرات التي سيتم أخذها ، يجب تحضير الشريحة ، ووضع قطرتين تقريبًا من محلول ملحي فسيولوجي معقم.

إذا كانت لوحة الثقافة الأصلية تحتوي على عدة أنواع مختلفة من المستعمرات ، فسيتم اختيار مستعمرة معزولة من كل منها لأداء الجرام. سيتم أخذ كل مستعمرة بحلقة البلاتين لتذوب في محلول ملحي تم وضعه مسبقًا على الشريحة.

يتم إجراء حركات دائرية من المركز باتجاه المحيط ، لتوزيع المستعمرة بشكل متجانس على الشريحة.

اتركه يجف تلقائيًا في الهواء. بمجرد أن تجف ، يتم تثبيت اللوح بالحرارة ، كما هو موضح سابقًا (عن طريق حرق الشريحة بالولاعة) ، مع الحرص على عدم حرق المادة.

يجب أن يتم هذا الإجراء مع كل نوع مختلف من المستعمرات. على قطعة من الورق ، يجب ملاحظة ترتيب ما لوحظ ، على سبيل المثال:

المستعمرة 1: مستعمرة صفراء بيتا للدم: لوحظ وجود مكورات موجبة الجرام في العناقيد

المستعمرة 2: مستعمرة ملونة قشدية ، بدون انحلال دم: لوحظ وجود عصيات سالبة الجرام.

يجب تسمية كل شريحة لمعرفة ما نلاحظه.

تقنية

تقنية صبغ غرام سهلة للغاية وغير مكلفة نسبيًا ولا يمكن تفويتها في مختبر علم الأحياء الدقيقة.

يتم على النحو التالي:

1. إصلاح اللطاخة بالحرارة ووضعها على جسر التلوين.
2. قم بتغطية الشريحة بالكامل باللون البنفسجي الكريستالي لمدة دقيقة واحدة.
3. يغسل بالماء لا تجف
4. غطي الورقة بمحلول لوغول ، واتركيه لمدة دقيقة واحدة. يغسل بالماء لا تجف.
5. مبيض لمدة 5-10 ثوان مع اهتزاز لطيف في أسيتون الكحول. أو ضع الورقة في وضع عمودي وقم بإسقاط قطرات من مزيل اللون على السطح حتى تتم إزالة الفائض من الزجاج البنفسجي غير المحتوي. لا تتجاوز.
6. يغسل بالماء لا تجف.
7. استبدل الشريحة الموجودة على جسر التلوين والغطاء لمدة 30 ثانية بالسفرانين (غرام-هاكر) أو دقيقة واحدة باستخدام الفوشسين الأساسي (جرام-كوبلوف).
8. يغسل بالماء
9. اتركه يجف تلقائيًا في وضع رأسي.

بمجرد أن يجف ، ضع قطرة واحدة من زيت الغمر لملاحظته تحت هدف 100X في المجهر الضوئي.

خدمة

تسمح هذه التقنية بتمييز الاختلافات الشكلية لمعظم البكتيريا.

تتميز الخمائر أيضًا بهذا التلوين. يأخذون الكريستال البنفسجي ، أي أنهم يصبغون إيجابية الجرام.

من ناحية أخرى ، يمكن تمييز العصيات البوغية إيجابية الجرام ، حيث يتم ملاحظة مساحة واضحة داخل العصية ، حيث تشكلت البوغ ، على الرغم من أن الجراثيم لا تلوث جيدًا. تُستخدم تقنيات أخرى مثل Shaeffer-Fulton لتلطيخ الجراثيم.

وتجدر الإشارة إلى أن هذا التلوين لا يستخدم لتلوين جميع أنواع البكتيريا ، أي أن هناك حالات لا يعمل فيها التلوين.

في هذه الحالة يمكن ذكر البكتيريا التي تفتقر إلى جدار خلوي. على سبيل المثال: جنس Mycoplasma ، spheroplasts ، ureaplasma ، L- أشكال و protoplasts.

كما أنها تلطخ البكتيريا بشدة بجدران غنية بالأحماض الفطرية ، مثل المتفطرة ، والبكتيريا داخل الخلايا مثل الكلاميديا ​​والريكتسيات.

كما أنه غير فعال في تلطيخ معظم البكتيريا اللولبية.

توجد بكتيريا من نفس الجنس يمكن ملاحظتها في نفس العينة مثل موجبة الجرام وسالبة الجرام. عندما يحدث هذا يطلق عليه صبغة جرام المتغيرة ، والتي يمكن أن تكون بسبب التغيير في العناصر الغذائية أو درجة الحرارة أو درجة الحموضة أو تركيز الإلكتروليت.

الأخطاء الشائعة

التبييض المبالغ فيه

يمكن أن تؤدي المبالغة في خطوة تغيير اللون إلى ملاحظة الكائنات الدقيقة السالبة الجرام الزائفة.

لا تنتظر وقتًا طويلاً للتجفيف الكافي لإضافة زيت الغمر

يمكن أن يتسبب في تلطيخ البكتيريا موجبة الجرام سالبة الجرام (سلبية الجرام الزائفة). يحدث هذا لأنه في الثقافات القديمة من المحتمل أن تكون بكتيريا ميتة أو فاسدة وفي ظل هذه الظروف لا تحتفظ البكتيريا باللون البنفسجي البلوري.

استخدم محلول اللوغول القديم جدًا:

بمرور الوقت يفقد اللوغول خصائصه ويتلاشى لونه. إذا تم استخدام الكاشف المتحلل بالفعل ، فلن يقوم بإصلاح الكريستال البنفسجي جيدًا ، وبالتالي هناك إمكانية للحصول على تصور للكائنات الحية الدقيقة سالبة الجرام الزائفة.

الخلفية الزرقاء

ستكون الخلفية التي تغير لونها بشكل صحيح حمراء. تشير الخلفية الزرقاء إلى أن اللون لم يكن كافياً.

المراجع

1. ريان كج ، راي سي 2010. شيريس. الأحياء الدقيقة الطبية ، الطبعة السادسة ماكجرو هيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية
2. Koneman E ، Allen S ، Janda W ، Schreckenberger P ، Winn W. (2004). التشخيص الميكروبيولوجي. (الطبعة الخامسة). الأرجنتين ، الافتتاحية Panamericana SA
3. Forbes B، Sahm D، Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 إد. الأرجنتين. التحرير Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. علم الفطريات العام. الطبعة الثانية جامعة فنزويلا المركزية ، إصدارات المكتبات. فنزويلا كراكاس.
5. "غرام وصمة عار." ويكيبيديا، الموسوعة الحرة. 4 أكتوبر 2018، 23:40 UTC. 9 ديسمبر 2018، 17:11. مأخوذة من es.wikipedia.org.
6. González M، González N. 2011. دليل علم الأحياء الدقيقة الطبية. الطبعة الثانية ، فنزويلا: مديرية الإعلام والمطبوعات بجامعة كارابوبو.
7. López-Jácome L، Hernández-Durán M، Colín-Castro C، Ortega-Peña S، Cerón-González G، Franco-Cendejas F. البقع الأساسية في مختبر الأحياء الدقيقة. البحث في الإعاقة. 2014 ؛ 3 (1): 10-18.