اختبار كاتالاز: الأساس المنطقي والتقنية والاستخدامات - مادة الاحياء - 2026

ل اختبار الكاتلاز هو المنهجية المستخدمة في مختبرات علم الجراثيم للكشف عن وجود إنزيم الكاتلاز في تلك البكتيريا التي تمتلكها. جنبا إلى جنب مع صبغة جرام ، فهي الاختبارات الرئيسية التي يجب إجراؤها على الكائنات الحية الدقيقة المعزولة حديثًا. ترشد هذه الاختبارات عالم الأحياء الدقيقة إلى الخطوات التي يجب اتباعها من أجل التحديد النهائي للكائن الدقيق المعني.

بشكل عام ، تمتلك البكتيريا التي تحتوي على السيتوكروم إنزيم الكاتلاز ، مما يعني أن البكتيريا الهوائية واللاهوائية الاختيارية يجب أن تمتلكه. ومع ذلك ، هناك استثناءات ، مثل Streptococcus ، والتي على الرغم من كونها كائنات دقيقة لاهوائية اختيارية ، إلا أنها لا تمتلك إنزيم الكاتلاز.

إجراء اختبار Catalase ، وإظهار رد فعل إيجابي. المصدر: لم يتم تقديم مؤلف يمكن قراءته آليًا. يفترض ناس (بناءً على مطالبات حقوق النشر).

هذا هو السبب في أن اختبار الكاتلاز يستخدم في المقام الأول للتمييز بين عائلات Staphylocaceae و Micrococaceae (كلاهما إيجابي الكاتلاز) من عائلة Streptococaceae (سلبية الكاتلاز).

وبالمثل ، فإن جنس Bacillus (إيجابي الكاتلاز) يتميز عن جنس Clostridium (سلبي الكاتلاز) ، من بين آخرين.

أساس

الكاتلاز هو إنزيم مصنف على أنه هيدروبيروكسيداز ، وهذا يعني أنهم يستخدمون بيروكسيد الهيدروجين (H ₂ O ₂) كركيزة.

يعتبر أيضًا أوكسيدوروكتاز ، لأنه في التفاعل حيث يشارك هناك عنصر يعمل كمانح للإلكترون (مادة مختزلة) وآخر كمستقبل للإلكترون (مادة مؤكسدة).

الكاتلاز عبارة عن بروتين يحتوي على مجموعة بروسيريك مع أربع ذرات حديد ثلاثية التكافؤ (Fe ⁺⁺⁺) ، لذلك فهو بروتين متجانس. يتأكسد أيون الحديديك أثناء التفاعل.

يمكن القول أن الكاتلاز هو إنزيم لإزالة السموم ، حيث تتمثل وظيفته في القضاء على المواد التي يتم إنتاجها أثناء التمثيل الغذائي للبكتيريا والتي تكون سامة للبكتيريا. من بين هذه المواد بيروكسيد الهيدروجين.

يتكون بيروكسيد الهيدروجين من تكسير السكريات الهوائية. تحدث هذه العملية على النحو التالي:

يتكون أيون الأكسيد الفائق (O ₂ ^-) (الجذور الحرة) كمنتج نهائي لامتصاص الجلوكوز بالطريق الهوائي. هذه المادة سامة ويتم التخلص منها عن طريق ديسموتاز الإنزيم الفائق الذي يحولها إلى أكسجين غازي وبيروكسيد الهيدروجين.

يعتبر بيروكسيد الهيدروجين سامًا أيضًا للبكتيريا ويجب إزالته. يحلل إنزيم الكاتلاز بيروكسيد الهيدروجين إلى ماء وأكسجين.

يمكن أن يعمل الكاتلاز على ركائز أخرى غير بيروكسيد الهيدروجين ، مثل الكحولات والألدهيدات والأحماض والأمينات العطرية والفينولات. ومع ذلك ، يمكن أيضًا استخدام بيروكسيد الهيدروجين بواسطة الكاتلاز لأكسدة المركبات السامة الأخرى مثل الميثيل والكحول الإيثيلي.

وبالمثل ، يوجد الكاتلاز في الخلايا البلعمية ، مما يحميها من التأثير السام لبيروكسيد الهيدروجين.

تقنية روتينية لاختبار كاتالاز

طريقة -Slide

المواد

3٪ بيروكسيد الهيدروجين (10 مجلدات).

شريحة المجهر

مقبض بلاستيكي أو مسواك خشبي.

معالجة

خذ ما يكفي من المستعمرة للدراسة دون لمس الأجار الذي أتت منه. يجب أن تكون المستعمرة طازجة ، أي من 18 إلى 24 ساعة.

ضع المستعمرة على الشريحة الجافة وأضف قطرة 3٪ من بيروكسيد الهيدروجين إليها (يمكن أيضًا استخدام 30٪ H ₂ O ₂). لاحظ على الفور ما إذا تم إطلاق الفقاعات أم لا.

ترجمة

رد فعل إيجابي: تطور الغاز ، يتضح من تكوين فقاعات (فقاعات قوية).

رد فعل سلبي: لا تشكل فقاعة.

- الطريقة المباشرة في الثقافة البحتة

ضع 1 مل من 3٪ H ₂ O ₂ على طبق نقي أو ثقافة إسفينية لا تحتوي على دم (يفضل أجار مغذي). لاحظ ما إذا كان هناك تكوين فقاعة على الفور أم لا. يمكن أيضًا استخدام 30٪ H ₂ O ₂.

يتم تفسيره بنفس طريقة كائن بورتا.

- الطريقة مع الأنبوب الشعري أو الفطر والبتريشكو

ملء أنبوب شعري 67 مم بارتفاع 20 مم بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين بواسطة الشعيرات الدموية.

المس المستعمرة المعزولة المراد دراستها بالشعرية المملوءة بـ 3٪ H ₂ O ₂ . لاحظ ما إذا كانت الشعيرات الدموية تمتلئ بالفقاعات في حوالي 10 ثوانٍ. تسمح هذه الطريقة بتقدير شبه كمي للتفاعل في الصلبان:

بدون الصلبان لا توجد فقاعات (رد فعل سلبي).

+ ---- فقاعات قليلة (رد فعل ضعيف أو متأخر).

++ --– فقاعات وفيرة (رد فعل معتدل).

+++ - تصل الفقاعات إلى الطرف الآخر (رد فعل قوي).

- طريقة Taylor و Achanzar لاختبارات الكاتلاز التي تعطي شكوكاً

ضع مستعمرة معزولة على شريحة نظيفة وجافة ، ثم ضع قطرة بنسبة 0.5٪ H ₂ O ₂ وقم بتغطيتها بغطاء. لاحظ ما إذا كان هناك تكوين للفقاعات المحاصرة أم لا.

التفسير: وجود فقاعات يدل على رد فعل إيجابي. لا توجد فقاعات ، يتم تفسيرها على أنها رد فعل سلبي.

اختبار الكاتلاز لأنواع المتفطرة

يجب تنفيذ هذه التقنية من خلال التحكم في درجة الحموضة ودرجة الحرارة. يجب أن يتم تنفيذه تحت غطاء التدفق الصفحي ، لأن التلاعب بأنواع المتفطرة المختلفة أمر خطير.

-المواد

بيروكسيد الهيدروجين 30٪ أو 110 مجلدات (سوبروكسال).

عازلة الفوسفات درجة الحموضة 7

10٪ توين 80

استزراع آسفين المتفطرات لمدة 3 إلى 4 أسابيع

-تجهيز

عازلة الفوسفات درجة الحموضة 7

لوزن:

1.361 جرام من فوسفات البوتاسيوم اللامائي (KH ₂ PO ₄).

1.420 جم من فوسفات ثنائي الصوديوم اللامائي (Na2HPO3).

قم بإذابة الأملاح في القليل من الماء المقطر المعقم واصنع ما يصل إلى 1000 مل من الماء.

10٪ توين 80

قم بإجراء تخفيف بنسبة 1:10 إلى Tween 80 المركز تجاريًا ، للقيام بذلك تابع على النحو التالي:

خذ 1 مل من توين 80 وضعه في القليل من الماء المقطر ، قم بإذابه ثم شكّل الحجم بالماء حتى 10 مل.

كاشف نهائي

امزج كمية من محلول الفوسفات بكمية 10٪ توين 80 (أجزاء متساوية). حدد في المختبر المقدار الذي تريد تحضيره.

-معالجة

ضع 5 مل من محلول الفوسفات في أنبوب اختبار معقم مغطى ببراغي (الباكليت).

باستخدام حلقة التلقيح ، خذ مستعمرة كافية لنمو المتفطرة المصنفة في أسافين وتذوب في المخزن المؤقت للفوسفات.

قم بتغطية الأنبوب دون شد الخيط. ضعه في حمام مائي عند 68 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. أخرجه واتركه يبرد حتى 22-25 درجة مئوية

قم بقياس 0.5 مل من الكاشف النهائي (المزيج) وأضفه إلى الأنبوب مع المحلول البارد. راقب تكوين الفقاعات أم لا.

يتم تفسيره بنفس الأساليب السابقة.

استعمال

عندما يتم الحصول على نمو المستعمرة في الوسائط المخصبة ، يجب إجراء اختبار صبغة جرام وكاتلاز على المستعمرات التي تم الحصول عليها. سيوجه هذا عالم الأحياء الدقيقة بشأن الإجراءات التي يجب اتباعها لتحديد الهوية النهائية.

المصدر: من إعداد المؤلف ماجستير. مارييلسا جيل

سؤال وجواب

لتقييم الأداء الجيد لكاشف بيروكسيد الهيدروجين ، استخدم سلالات التحكم المزروعة حديثًا ، مثل Staphylococcus aureus كعنصر تحكم إيجابي وسلالات Streptococcus sp كعنصر تحكم سلبي.

البديل الآخر الذي يعمل كعنصر تحكم إيجابي هو وضع قطرة من بيروكسيد الهيدروجين على أجار الدم ، تحتوي كريات الدم الحمراء على الكاتلاز ، وبالتالي ، سيكون هناك فقاعات إذا كان الكاشف في حالة جيدة.

يمكن استخدام أجار الشوكولاتة كعنصر تحكم سلبي ، وهنا تكون كريات الدم الحمراء مفسدة بالفعل والاختبار سلبي.

محددات

- لا تستخدم الثقافات القديمة للاختبار ، لأن هذا يمكن أن يسبب نتائج سلبية خاطئة.

- تجنب أخذ المستعمرات من الثقافات على أجار الدم ، إذا كنت حريصًا على عدم لمس الأجار ؛ يمكن أن يؤدي هذا الإجراء إلى نتائج إيجابية خاطئة ، حيث تحتوي خلايا الدم الحمراء على مادة الكاتلاز.

- إذا أخذت المستعمرة بمقبض بلاتيني ، فلا تقم بعكس ترتيب الإجراء لأن هذا يمكن أن يولد نتائج إيجابية خاطئة. وذلك لأن البلاتين قادر على التفاعل مع بيروكسيد الهيدروجين ، مما يتسبب في حدوث فقاعات.

- لا تستخدم كاشف بيروكسيد الهيدروجين إذا كان قديمًا جدًا ، حيث أن الكاشف غير مستقر للغاية ويميل إلى الانهيار بمرور الوقت.

- حافظ على كاشف بيروكسيد الهيدروجين محميًا من الضوء ومبردًا لمنع التلف.

- قم بضبط جودة كاشف بيروكسيد الهيدروجين في كل مرة يتم استخدامه.

- ضع في اعتبارك أنه إذا تم استخدام 30٪ H ₂ O ₂ ، فإن التفاعلات تكون أقوى من تلك التي أجريت مع 3٪ H ₂ O ₂.

المراجع

1. Koneman E ، Allen S ، Janda W ، Schreckenberger P ، Winn W. (2004). التشخيص الميكروبيولوجي. 5th إد. التحرير Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B، Sahm D، Weissfeld A. (2009). بيلي وسكوت التشخيص الميكروبيولوجي. 12 إد. التحرير Panamericana SA Argentina.
3. ماك فادن ج. (2003). الاختبارات البيوكيميائية لتحديد البكتيريا ذات الأهمية السريرية. الطبعة الثالثة. افتتاحية بان أميريكانا. بوينس ايرس. الأرجنتين.
4. مختبرات BD. كاشف كاتالاز-جوتاريو. متاح على:
5. مختبرات Vadequímica. بيروكسيد. التكافؤ بين الأحجام والنسبة المئوية. متاح على: vadequimica.com