اللطاخة البكتيرية: الخصائص والتحضير - مادة الاحياء - 2025

و تشويه البكتيرية هي رقيقة مسحة من تعليق من الكائنات الحية الدقيقة البكتيرية التي يتم إجراؤها على طبق من الزجاج الشفاف أو الشريحة، للمراقبة تحت المجهر الضوئي.

يتم تنفيذ التمديد في شكل فيلم لفصل الكائنات الدقيقة قدر الإمكان ، لأنه إذا تم تجميعها ، فإن الملاحظة غير واضحة.

الشكل 1. مسحة بكتيرية شوهدت تحت المجهر الإلكتروني الماسح. المصدر: pixbay.com

في دراسة الثقافات البكتيرية ، يتم استخدام تقنيات تحضير اللطاخة والتثبيت والتلوين لتحليلها بشكل أفضل. نظرًا لصغر حجم الكائنات الحية الدقيقة ، فإن استخدام المجهر الضوئي مطلوب بالضرورة لملاحظتها.

المجاهر الضوئية هي أدوات أساسية لمراقبة المسحات. تستخدم هذه العدسات البصرية والضوء مما يسمح برؤية العينات بتكبير عالٍ.

بشكل عام ، لا تحتوي الخلايا الحية على هياكل ملونة في الغالب ، حيث تُرى بالمجهر الضوئي فهي عينات شفافة عديمة اللون ، وتظهر القليل جدًا من التباين الداخلي ومع بيئتها.

المراقبة باستخدام مجهر الضوء البسيط للمجال الضوئي ، دون استخدام تقنيات التلوين المساعدة ، محدودة للغاية ولا تستخدم إلا في بعض الحالات ، مثل مراقبة حركة الكائنات الحية الدقيقة.

من أجل المراقبة المثلى للكائنات الحية الدقيقة ، يجب تحقيق توازن بين التباين والدقة. لا يمكن رؤية تفاصيل الخلايا تحت المجهر ، حتى مع الدقة العالية ؛ مطلوب استخدام الأصباغ من خلال تقنيات التلوين ، والتي توفر تباينًا للمراقبة.

خصائص اللطاخة البكتيرية ذات النوعية الجيدة

تباين ممتاز

لتحقيق تباين ممتاز ، توجد مجاهر متطورة تسمى مجاهر تباين الطور ، ومجاهر التداخل التفاضلي ، ومجاهر المجال المظلم. يستخدم هذا النوع من المجاهر لمراقبة الهياكل البكتيرية مثل الأغماد والخيوط وغيرها.

التلوين هو تقنية بسيطة لزيادة التباين الذي يتحقق باستخدام مجهر المجال الساطع. في هذه التقنية ، يمكن استخدام بقع مختلفة ، مما يحسن بشكل كبير الملاحظة المجهرية.

يتم إجراء البقع مباشرة على مسحات أو امتدادات معلقات الكائنات الحية الدقيقة على الشرائح ، والتي تم تجفيفها وتثبيتها مسبقًا.

إصلاح جيد

التثبيت هو تقنية تستخدم للحفاظ على الهياكل الخلوية ؛ يتسبب في تعطيل الكائنات الحية الدقيقة والالتصاق بزجاج الشريحة. هناك علاجات تثبيت مختلفة: التثبيت الحراري والتثبيت الكيميائي.

تثبيت الحرارة

هذه هي الطريقة الأكثر استخدامًا لمراقبة المسحات البكتيرية. تتكون التقنية من تمرير المعلق البكتيري للمسحة عبر لهب الولاعة. هذه التقنية قادرة على الحفاظ على الشكل الخارجي للبكتيريا ، لكنها تدمر هياكلها الداخلية.

التثبيت الكيميائي

يستخدم التثبيت الكيميائي مواد كيميائية للحفظ ، مثل الفورمالديهايد أو الفورمالين والإيثانول وحمض الخليك ، من بين أشياء أخرى. ميزة استخدام عوامل التثبيت الكيميائي هي أن الحفاظ على الهياكل الخلوية الداخلية للكائنات الحية الدقيقة يتحقق.

الشكل 2. مسحة الدم. المصدر: Bobjgalindo، from Wikimedia Commons

تلطيخ جيد

أكثر الإجراءات شيوعًا لتلطيخ اللطاخة المجففة والثابتة سابقًا هي التلوين الإيجابي أو البسيط والتلطيخ التفاضلي والتلوين السلبي. هناك أيضًا تقنيات خاصة لتلوين هياكل خلوية معينة (كبسولة ، بوغ ، سوط).

تلطيخ إيجابي أو تلطيخ بسيط

التلوين الإيجابي أو البسيط هو أسلوب تلطيخ المسحة الأكثر استخدامًا. يستخدم الأصباغ التي لديها القدرة على الارتباط ببعض الهياكل الميكروبية ، مما يسمح برصدها تحت المجهر.

تحتوي هذه الأصباغ على مجموعات صبغية (جزء ملون) في تركيبها الكيميائي ، مع روابط مزدوجة متناوبة وروابط مفردة (اقتران). يمكن لهذه الروابط بدورها إنشاء روابط أيونية أو تساهمية مع بعض الهياكل الخلوية.

الأصباغ المستخدمة في التلوين الإيجابي أو البسيط هي في الغالب مشتقات كيميائية للأنيلين (أملاح عضوية ملونة).

من ناحية أخرى ، من بين الأصباغ ، يمكن أن نجد بعضها يحتوي على درجة حموضة أساسية والبعض الآخر يحتوي على درجة حموضة حمضية.

الملونات الأساسية

في الأصباغ الأساسية ، تحتوي مجموعة الكروموفور على شحنة كهربائية موجبة. الغالبية العظمى من الكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة لها درجة حموضة داخلية محايدة ، وسطحها الخلوي سالب الشحنة. من خلال هذا التفاعل الكهروستاتيكي ، يرتبط حامل الكروم بالخلية ويلطخها.

ومن الأمثلة على الأصباغ الأساسية الأزرق الميثيلين ، والبنفسجي الكريستالي ، والأخضر الملكيت ، والفوسين الأساسي ، والسفرانين ، وغيرها.

الأصباغ الحمضية

في الأصباغ الحمضية ، تحتوي مجموعة الكروموفور على شحنة كهربائية سالبة. تستخدم هذه لتلطيخ البروتينات بمجموعات أمينية موجبة الشحنة. من أمثلة الأصباغ الحمضية الفوسين الحمضي والوردي البنغال والكونغو الأحمر ويوزين.

تلطيخ تفاضلي

تتكون تقنية التلوين التفاضلي من تطبيق صبغتين بلون أو كثافة مختلفة ، لتمييز الكائنات الحية الدقيقة المختلفة تحت المجهر. تعد صبغة جرام وصمة عار مقاومة الكحول من أكثر البقع التفاضلية شيوعًا في علم الجراثيم.

يتم استخدام صبغة جرام كاختبار أولي لمعرفة الشكل والحجم وتجميع الخلايا ، وكذلك نوع جدار الخلية. باستخدام اختبار صبغة جرام ، يتم تصنيف بكتيريا جدار الخلية إلى بكتيريا موجبة الجرام وبكتيريا سالبة الجرام.

تلطيخ سلبي

في هذه التقنية ، يتم استخدام الأصباغ الكيميائية التي لا تخترق داخل الخلية ، ولكنها تصنع الوسط الذي تظهر فيه الكائنات الحية الدقيقة كخلفية سوداء.

في تقنية التلوين السلبي ، تُصنع اللطاخة بقطرة من الحبر الهندي أو تعليق النيجروسين ، والذي بعد السماح بالتجفيف في درجة حرارة الغرفة يشكل طبقة غير شفافة لمرور الضوء. بهذه الطريقة ، تظهر الكائنات الحية الدقيقة كأشكال زاهية على خلفية داكنة.

تجهيز

A. مسحة

1.- اغسل الشرائح جيدًا وجففها بورق ماص وقم بتسميتها. يجب أن تشير الملصق إلى محتوى التحضير وتاريخ واسم الشخص الذي قام بمعالجته.

2.- أشعل القداحة وعقم حلقة التلقيح في اللهب حتى يصبح أحمر فاتح.

3.- دع المقبض يبرد.

4.- خذ أنبوب الاستزراع البكتيري ، انزع الغطاء وقم بتمرير فم الأنبوب بسرعة بالقرب من لهب الموقد (اللهب).

5.- أدخل حلقة التلقيح في الأنبوب الذي يحتوي على الثقافة البكتيرية وأخذ العينة.

6.- إذا كانت المزرعة في وسط سائل ، ضع العينة المأخوذة بالمقبض في وسط الشريحة وانشرها بعناية في دائرة قطرها حوالي 2 سم.

7.- تعقيم حلقة التلقيح مرة أخرى.

8.- اترك المسحة تجف في الهواء.

9.- كرر الخطوات من 3 إلى 8 ثلاث مرات.

10.- إذا كانت المزرعة في وسط صلب ، فيجب وضع قطرة ماء مقطر مسبقًا على الشريحة. يتم إجراء ذلك لخلط عينة صغيرة من الثقافة المأخوذة مع حلقة التلقيح ، كما هو محدد في الخطوات من 2 إلى 5 (ظروف التعقيم).

11.- انشر العينة المخففة مع قطرة ماء على الشريحة وكرر ذلك ثلاث مرات.

ب. التثبيت

1.- أضف قطرتين من الميثانول أو الإيثانول المطلق إلى المسحات الجافة - من المزارع في وسط سائل -.

2.- اترك الهواء يجف بعيدًا عن الولاعة.

3.- إذا كانت اللطاخة ناتجة عن مزرعة على وسط صلب ، يتم تثبيت المسحة الجافة بالحرارة ، وتمريرها مرتين إلى ثلاث مرات بسرعة عبر الجزء الأكثر سخونة من اللهب الأخف.

4.- المس الجزء السفلي من اللطاخة بالجزء الظهري من اليد اليسرى (لليد اليمنى وإلا استخدم اليد اليمنى) وتأكد من أنها باردة.

جيم بسيط تلطيخ

1.- أضف قطرتين من البقعة المختارة إلى اللطاخة واتركها تعمل للمدة المطلوبة في البروتوكولات المحددة لكل بقعة (بشكل عام بين 1 و 5 دقائق).

2.- تتطلب بعض البقع استخدام الحرارة لتنشيطها ، وفي هذه الحالة من الضروري توخي الحذر الشديد عند تسخين الشريحة في لهب أخف (تعامل معها بالملقاط وتجنب الغليان). يمكن أن يؤدي ارتفاع درجة حرارة المسحة إلى تدمير الخلايا المراد ملاحظتها.

3.- إزالة الملونات الزائدة عن طريق الغسيل بالماء المقطر من picette. قم بإزالة ماء الغسيل عن طريق النقر برفق على الشريحة الموجودة على حافتها ، مائلة على طاولة العمل.

4.- السماح للهواء بالتجفيف.

5.- اعتمادًا على نوع الملاحظة ، يتم استخدام ساترة أم لا في هذه المرحلة. الغطاء يحمي ويحافظ على اللطاخة. إذا تم إجراء ملاحظة الغمر بالزيت في هذه المرحلة ، فلا يتم استخدام أغطية واقية ولكن لا يمكن حفظ اللطاخة.

د- المحافظة النهائية على اللطاخة

1.- غمر اللطاخة على التوالي في كل من المحاليل الموضحة أدناه لمدة لا تقل عن 5 دقائق. الغرض من هذه "الحمامات" هو تجفيف المسحة تمامًا. يجب تجفيف كل كاشف جيدًا قبل إدخال اللطاخة في الحمام التالي.

ترتيب حمامات التجفيف كالتالي:

1. الإيثانول 70٪
2. الايثانول 95٪
3. الأسيتون النقي
4. مزيج الأسيتون - زيلول 1: 1
5. زيلول

ثم اتركها لتجف في الهواء.

2.- قم بتركيب الغطاء ، ويفضل أن يكون 22 × 22 مم ، باستخدام بلسم كندا أو أي وسيلة تثبيت أخرى.

المراجع

1. بريجز ، ج. (1965). العوامل المسببة في حوادث المختبرات الميكروبيولوجية والعدوى. المختبرات البيولوجية للجيش الأمريكي. فورت ديتريك.
2. كابتشينو ، جي جي وويلش ، سي تي (2017). علم الأحياء الدقيقة: دليل المختبر. بيرسون.
3. هولت ، محرر JG. (1977). دليل بيرجي الأقصر لعلم الجراثيم المحدد. 8 ^تشرين بالتيمور: وليامز وشركاه ويلكنز
4. جونسون ، تي آر وكيس ؛ سي إل (2018). التجارب المعملية في علم الأحياء الدقيقة. بيرسون.
5. تيل ، ب. (2017). علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. 14 ^تشرين سانت لويس، الولايات المتحدة الأمريكية: Elsiever، وشركة