وسط LÖWENSTEIN-JENSEN: الأساس والتحضير والاستخدام - مادة الاحياء - 2025

يعد وسط Löwenstein-Jensen وسطًا صلبًا انتقائيًا لعزل وتطوير بكتيريا من جنس المتفطرة Mycobacterium ، مثل Mycobacterium tuberculosis ، M. avium ، من بين أمور أخرى ، باستثناء الأنواع الجذامية ، التي لا يمكن زراعتها.

لا تنمو البكتيريا من جنس المتفطرة في وسط الاستزراع التقليدي ، لذلك كان من الضروري تصميم وسط خاص لعزلها. تم إنشاء الوسيط الأصلي بواسطة Löwenstein وتم تعديله لاحقًا بواسطة Jensen.

وسط Löwenstein-Jensen مع مستعمرات Mycobacterium tuberculosis. المصدر: Agarwal et al / BioMed Central Ltd. ، بإذن من مكتبة الصور البيولوجية

يتمثل التعديل في التخلص من صبغة الكونغو الحمراء ، واستبدالها بتركيز أعلى من الملكيت الأخضر. كما أنها غيرت تركيز سترات المغنيسيوم وفوسفات أحادي البوتاسيوم.

يحتوي وسط Löwenstein-Jensen حاليًا على نشا البطاطس ، والأسباراجين ، وسيترات المغنيسيوم ، وفوسفات البوتاسيوم الأحادي ، وكبريتات المغنيسيوم ، والأخضر المالاكيت ، وحمض الناليديكسيك ، وسيكلوهيكسيميد ، ولينومايسين ، والبيض المخفوق ، والجلسرين ، والماء.

عادة ما يتم عزل البكتيريا الفطرية من المواقع غير المعقمة ، مثل البلغم والبول والخراجات وغيرها. هذا يعني أن معظم العينات ستحتوي على الجراثيم المعتادة في المنطقة ، بالإضافة إلى العامل الممرض.

هذا هو السبب في أن وسط Löwenstein-Jensen يحتوي في تركيبته على سلسلة من المثبطات التي يمثلها الملكيت الأخضر والمضادات الحيوية ومضادات الفطريات.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب إزالة التلوث من العينات التي تأتي من مواقع غير معقمة وتحييدها قبل زرعها في وسط Löwenstein-Jensen.

أساس

إن وجود البيض والجلسرين في وسط Löwenstein-Jensen يحفز نمو البكتيريا الفطرية لأنها توفر الأحماض الدهنية والبروتينات اللازمة لتطوير هذه الكائنات الحية الدقيقة.

يحتوي وسط Löwenstein-Jensen على أخضر الملاكيت ، وهو مثبط للميكروبات المصاحبة. ولكنه يحتوي أيضًا على حمض الناليديكسيك (35 ميكروغرام / مل) ، الذي يثبط الميكروبات سالبة الجرام ، سيكلوهكسيميد (400 ميكروغرام / مل) ، والذي يثبط الفطريات والخمائر الرخامية ، ولينكومايسين (2 ميكروغرام / مل) ، مما يثبط الميكروبات إيجابية الجرام.

تفضل بعض البيوت التجارية إضافة التركيبة التالية من المضادات الحيوية: بوليميكسين ب 200000 وحدة / لتر ، أمفوتيريسين ب 10 مجم / لتر ، كاربينيسيلين 50 مجم / لتر وتريميثوبريم 10 مجم / لتر.

لا يحتوي هذا الوسط على أجار ، لذلك يحدث تصلب الوسط بسبب تخثر الألبومين الموجود في البويضة أثناء التعقيم.

تجهيز

تزن 37.3 جم من الوسط المجفف في 600 مل من الماء المقطر الذي سبق إضافة 12 مل من الجلسرين إليه. يسخن الخليط مع التقليب باستمرار حتى يذوب تمامًا. الأوتوكلاف الوسيط عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

من ناحية أخرى ، يجب تحضير معلق متجانس 1000 مل من البيض الطازج تحت ظروف معقمة. يضاف معلق البيض إلى 600 مل من الوسط المحضر عند درجة حرارة 50-60 درجة مئوية ، مع تجنب فقاعات الهواء.

تضاف محاليل المضادات الحيوية أيضًا بعد التعقيم في الأوتوكلاف.

صب الوسيط في أنابيب اختبار معقمة مغطاة بالمسمار. تسخين الأنابيب عند 85 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في وضع مائل.

لون الوسط المحضر أخضر زبرجد وقد تظهر بقع بيضاء بسبب وجود دهون البيض.

يجب أن يكون الأس الهيدروجيني للوسط 7.2 ± 0.2

تخزين الأنابيب في الثلاجة ومحمية من الضوء المباشر حتى الاستخدام. المزاج قبل البذر.

هناك تعديل للوسيط يسمى "تعديل Gruft لـ Löwenstein Jensen". يحتوي هذا على نفس المركبات الموجودة في الوسط الكلاسيكي ولكن يضاف RNA-5mg / 100 ml ، وكمثبطات تحتوي على أخضر الملاكيت 0.025 جم / 100 مل ، بنسلين 50 U / مل وحمض الناليديكسيك 35 ميكروغرام / مل.

التطبيقات

يتم استخدام وسط Löwenstein-Jensen لعزل المتفطرات من أنواع مختلفة من العينات. يوصى باستخدام بقعة Ziehl-Neelsen لأي عينة يشتبه في وجود المتفطرات فيها.

تأتي بعض العينات من مواقع معقمة لكن البعض الآخر لا يأتي. يجب إزالة التلوث من العينات غير المعقمة حسب الاقتضاء:

اللعاب

يجب إزالة التلوث من عينات البلغم على النحو التالي: تحديد كمية عينة البلغم بالمل وإضافة نفس الكمية من 4٪ هيدروكسيد الصوديوم إلى العينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية.

رج الخليط بشكل متكرر خلال 30 دقيقة. بعد ذلك الطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

تجاهل المادة طافية فوق محلول مطهر الفينول. استخدم الرواسب للبذر ، ولكن يجب أولاً معادلة الأس الهيدروجيني.

لتحييد الرواسب ، يستخدم 5٪ H ₂ SO ₄ في وجود مؤشر أحمر الفينول حتى يصل إلى درجة حموضة متعادلة تسبب لون السلمون.

غسل المعدة وغسل الشعب الهوائية وشفط الشعب الهوائية

في هذه الحالة ، يجب طرد العينة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. يتم التخلص من المادة الطافية ويتم استخدام الحبيبات. لتطهير الرواسب ، أضف 3 مل من 4٪ هيدروكسيد الصوديوم مع التقليب بشكل متكرر عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة.

جهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، يتم التخلص من المادة الطافية ويتم استخدام الحبيبات. يجب تحييد هذا الأخير كما هو موضح في عينة البلغم.

البول

اترك العينة لتستقر في الثلاجة لمدة 24 ساعة. افصل المادة الطافية. يجب طرد الحبيبات المتبقية لمدة 30 دقيقة عند 3000 دورة في الدقيقة. تخلص من المادة الطافية مرة أخرى وأعد تكوين الحبيبات بـ 3 مل من محلول فسيولوجي معقم.

أضف 3 مل من 4٪ هيدروكسيد الصوديوم وانتقل إلى إزالة التلوث والمعادلة كما هو موضح من قبل.

استسقاء السائل ، السائل الجنبي ، السائل النخاعي

في هذا النوع من العينة يتم طرده بالطرد المركزي ويتم التخلص من المادة الطافية. قم بعمل جرام على الرواسب أو راقب مباشرة تحت المجهر ؛ إذا لم يتم ملاحظة البكتيريا ، فإن خطوة إزالة التلوث ليست ضرورية ، ولا خطوة التحييد.

في هذه الحالة يمكن بذر العينة مباشرة باستخدام الرواسب. إذا كانت هناك بكتيريا ، فانتقل إلى إزالة التلوث وتحييده كما هو موضح أعلاه.

الخزعات

لهذا النوع من العينات ، يجب إضافة 5 مل من الماء المقطر إلى جهاز طرد مركزي لاحق عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد الطرد المركزي للحبيبات بسرعة 3500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. استخدم الرواسب لزرع وسط الثقافة.

مسحة من الحنجرة

يجب وضع المسحة في أنبوب معقم يحتوي على أجزاء متساوية من الماء المقطر و 4٪ هيدروكسيد الصوديوم. يجب ضغط المسحة على جدران الأنبوب بحيث يتم تخفيف العينة في السائل. الطرد المركزي واستخدام الرواسب. قم بإبطال مفعول الرواسب كما سبق وصفه.

زرعت

يتم تلقيح وسط Löwenstein-Jensen بإضافة 0.5 مل من العينة على سطح الوسط. قم بتدوير الأنبوب لتوزيع العينة في جميع أنحاء الوسط. لا تستخدم المقبض البلاتيني.

يمكن بذر الأنبوب الثاني الذي يحتوي على وسط Stonebrink لعزل Mycobacterium bovis والأنواع الأخرى التي لا تنمو على وسط Löwenstein-Jensen.

حضانة

يتم تحضين الأنابيب الملقحة هوائياً عند 37 درجة مئوية ، مع الغطاء فضفاض قليلاً ويميل عند حوالي 5 درجات ومحمية من الضوء. يمكن إثراء البيئة بنسبة 5-10٪ من ثاني أكسيد الكربون. افحص الثقافات مرتين في الأسبوع حتى تظهر المستعمرات.

عندما يتم امتصاص العينة ، يتم شد الأغطية. الحد الأقصى لوقت الحضانة هو 8 أسابيع ، إذا لم يكن هناك نمو بعد هذا الوقت ، يتم الإبلاغ عن أنه سلبي.

سؤال وجواب

يمكن استخدام السلالات التالية كمراقبة للجودة:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294، Mycobacterium kansasii ATCC 12478، Mycobacterium avium ATCC 19291، Mycobacterium bovis ATCC 19219، Mycobacterium Fortuitum ATCC 6841، Escherichia coli ATCC 25922، Streptococcus pyogenes 196

من المتوقع حدوث تطور ممتاز للأنواع الثلاثة الأولى المذكورة ، حيث يجب أن يكون نمو M. fortuitum جيدًا ، بينما من المتوقع أن يكون نمو M. bovis ضئيلًا أو معدومًا. وفي الوقت نفسه ، يجب منع الأنواع الأخرى من جنس المتفطرة تمامًا.

محددات

يجب حماية الوسيط المُعد من الضوء ، حيث يؤدي التعرض الطويل للضوء إلى تحول الوسيط من الأخضر إلى الأزرق ، وفي هذه الحالة لا يمكن استخدام الوسيط. هذا لأن الملكيت الأخضر حساس للضوء.

الوسيط ، لأنه يحتوي على بيض ، يمكن أن يتلوث بسهولة إذا لم يتم التعامل معه بطريقة معقمة. يمكن إذابته إذا أصبحت ملوثة بالبكتيريا المحللة للبروتين.

تتطلب زراعة البكتيريا من جنس المتفطرة والتعامل معها موظفين مؤهلين ، على دراية بتدابير السلامة الحيوية التي يجب اتباعها لتجنب التلوث أو تلويث الآخرين.

لا ينبغي استخدام حمض الهيدروكلوريك في خطوة التعادل بسبب تكوين كلوريد الصوديوم ، والذي يمكن أن يكون سامًا لعصيات كوخ.

يجب حفظ العينات في الثلاجة وحمايتها من الضوء أثناء عدم معالجتها.

مرجع

1. معامل فرانسيسكو سوريا ملغيزو. 2009. وسط انتقائي Löwenstein-Jensen. متاح في: f-soria.es
2. مختبرات بريتانيا. 2017. Löwenstein-Jensen متوسط. متاح على: britanialab.com.
3. مختبرات نيوجين. متوسط ​​Löwenstein-Jensen. متاح على: foodafety.neogen.com.
4. "متوسط ​​Löwenstein-Jensen." ويكيبيديا، الموسوعة الحرة. 20 تشرين الثاني (نوفمبر) 2018 ، الساعة 15:15 بالتوقيت العالمي المنسق. 24 أبريل 2019، 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E ، Allen S ، Janda W ، Schreckenberger P ، Winn W. (2004). التشخيص الميكروبيولوجي. 5th إد. التحرير Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B، Sahm D، Weissfeld A. (2009). بيلي وسكوت التشخيص الميكروبيولوجي. 12 إد. التحرير Panamericana SA Argentina.
7. ماك فادن ج. (2003). الاختبارات البيوكيميائية لتحديد البكتيريا ذات الأهمية السريرية. الطبعة الثالثة. افتتاحية بان أميريكانا. بوينس ايرس. الأرجنتين.